Cuando se criopreserva una muestra biológica, el movimiento molecular y los procesos celulares se ralentizan hasta el punto de transición vítrea en el que se detiene toda actividad, preservando células, tejidos e incluso organismos enteros durante años. Por consiguiente, no es de extrañar que la criopreservación sea el núcleo de la mayoría de las operaciones modernas de biobancos.
Pero aunque el concepto de congelación es sencillo, el proceso físico es bastante complejo. La forma en que se produce la congelación o vitrificación puede tener un impacto dramático en la viabilidad de las células y la calidad de la muestra cuando se devuelven a temperaturas más cálidas.
Exploraremos las propiedades físicas del hielo y los principales eventos en la congelación y descongelación de la muestra (que es tan importante como el enfriamiento) en una serie de entradas de blog que profundizan en el proceso de congelación. En esta primera entrada, empecemos por el principio y echemos un vistazo al primer paso de la congelación, la nucleación.
El agua pura enfriada por debajo del punto de congelación puede seguir siendo un líquido superenfriado hasta que se altere. (Este vídeo de abajo ofrece una gran ilustración de este punto y es un gran experimento científico casero para probar con los niños).
En el vídeo, golpear una botella de agua proporciona un sitio para que se formen cristales de hielo, o en otras palabras, un sitio para la nucleación. La nucleación es un proceso en el que las moléculas de un líquido comienzan a reunirse en pequeños grupos, organizándose de forma que definirán la estructura cristalina del sólido. Hay dos tipos de nucleación:
- La nucleación heterogénea, que ocurre cuando el hielo comienza a formarse alrededor de un sitio de nucleación, como una perturbación física, una impureza (como la sal) en el líquido o una irregularidad en un recipiente. Dado que las muestras biológicas nunca son agua pura, siempre experimentan una nucleación heterogénea.
- Nucleación homogénea, que ocurre cuando se forma hielo sin ningún sitio de nucleación predefinido. El agua pura se congelará a aproximadamente -39°C en ausencia de sitios de nucleación. En la práctica, sin embargo, la nucleación homogénea no se ve a menudo debido a la rareza del agua completamente pura.
Según una revisión en la revista Cryobiology, «La nucleación del hielo es la variable no controlada más significativa en la criopreservación convencional que conduce a la variación de muestra a muestra en la recuperación, viabilidad y función de las células.» Los autores recomiendan controlar el proceso de nucleación y enumeran varios métodos de congelación, muchos de los cuales se utilizan habitualmente para aplicaciones de FIV:
- Siembra: La introducción de un cristal de hielo externo para promover la nucleación a una temperatura determinada. Para minimizar los riesgos de contaminación, la siembra se realiza actualmente generando un punto frío en el exterior del recipiente, como las pinzas frías en el lado de una paja.
- Nucleantes químicos: Los cristales nucleantes de hielo se incluyen en el medio de la muestra. Los nucleantes químicos permiten una amplia estandarización entre los tipos de muestras y son un área activa de investigación.
- Electrocongelación: Se utiliza electricidad de alto voltaje para inducir la formación de hielo.
- Métodos mecánicos: La agitación, los golpes o la aplicación de ultrasonidos pueden ser eficaces para la nucleación, pero son difíciles de estandarizar.
- Enfriamiento por choque/congelación a velocidad controlada: Exponer la muestra a un conjunto rápido de rampas de temperatura puede promover la nucleación. Esto es lo que hace un congelador de velocidad controlada al conducir las muestras a través del proceso de nucleación.
- Cambio de presión: La nucleación puede inducirse presurizando la muestra, reduciendo la temperatura y liberando luego la presión.
Para una excelente introducción a las propiedades de la formación de hielo en los sistemas biológicos y más sobre el proceso de nucleación, consulte el capítulo uno del texto seminal de 2004 «Life in the Frozen State», una lectura muy recomendada para cualquier persona interesada en conocer estos procesos con mayor detalle.