Van ‘t Hoff obtuvo su primera reputación en el campo de la química orgánica. En 1874, explicó el fenómeno de la actividad óptica suponiendo que los enlaces químicos entre los átomos de carbono y sus vecinos se dirigían hacia las esquinas de un tetraedro regular. Esta estructura tridimensional explicaba los isómeros encontrados en la naturaleza. Comparte el mérito con el químico francés Joseph Le Bel, que tuvo la misma idea de forma independiente.
Tres meses antes de que se le concediera el título de doctor, Van ‘t Hoff publicó esta teoría, que hoy se considera el fundamento de la estereoquímica, primero en un panfleto holandés en otoño de 1874, y luego en mayo siguiente en un pequeño libro francés titulado La chimie dans l’espace. En 1877 apareció una traducción al alemán, en un momento en que el único trabajo que Van ‘t Hoff podía encontrar era en la Escuela de Veterinaria de Utrecht. En estos primeros años, su teoría fue ampliamente ignorada por la comunidad científica, y fue duramente criticada por un destacado químico, Hermann Kolbe. Kolbe escribió:
«Al Dr. J. H. van ‘t Hoff, de la Escuela de Veterinaria de Utrecht, no le gusta, aparentemente, la investigación química exacta. Ha considerado más conveniente montar en Pegaso (aparentemente prestado de la Escuela de Veterinaria) y proclamar en su ‘La chimie dans l’espace’ cómo, en su audaz vuelo a la cima del Parnaso químico, los átomos le parecían estar dispuestos en el espacio cósmico.»
Sin embargo, hacia 1880 el apoyo a la teoría de Van ‘t Hoff por parte de químicos tan importantes como Johannes Wislicenus y Viktor Meyer supuso su reconocimiento.
En 1884, Van ‘t Hoff publicó su investigación sobre cinética química, titulada Études de Dynamique chimique («Estudios de Dinámica Química»), en la que describió un nuevo método para determinar el orden de una reacción mediante gráficos y aplicó las leyes de la termodinámica a los equilibrios químicos. También introdujo el concepto moderno de afinidad química. En 1886, demostró la similitud entre el comportamiento de las soluciones diluidas y los gases. En 1887 fundó, junto con el químico alemán Wilhelm Ostwald, una influyente revista científica llamada Zeitschrift für physikalische Chemie («Revista de Química Física»). Trabajó en la teoría de Svante Arrhenius sobre la disociación de los electrolitos y en 1889 proporcionó una justificación física de la ecuación de Arrhenius. En 1896 se convirtió en profesor de la Academia Prusiana de Ciencias de Berlín. Sus estudios sobre los depósitos de sal de Stassfurt fueron una importante contribución a la industria química prusiana.
Van ‘t Hoff se convirtió en profesor de química y física en la Escuela de Veterinaria de Utrecht. A continuación, trabajó como profesor de química, mineralogía y geología en la Universidad de Ámsterdam durante casi 18 años antes de llegar a ser presidente del departamento de química. En 1896, Van ‘t Hoff se trasladó a Alemania, donde terminó su carrera en la Universidad de Berlín en 1911. En 1901 recibió el primer Premio Nobel de Química por sus trabajos con soluciones. Su trabajo demostró que las soluciones muy diluidas siguen leyes matemáticas que se parecen mucho a las leyes que describen el comportamiento de los gases.