La inmunohistoquímica (IHC) es una potente técnica basada en la microscopía para visualizar componentes celulares, por ejemplo, proteínas u otras macromoléculas en muestras de tejido. El punto fuerte de la IHC es el resultado visual intuitivo que revela la existencia y la localización de la proteína objetivo en el contexto de diferentes tipos de células, estados biológicos y/o localización subcelular dentro de tejidos complejos.
La técnica de IHC se inventó durante la década de 1940 (Coons, Creech, & Jones, 1941) y se utiliza de forma rutinaria como una herramienta importante en el cuidado de la salud y la patología para, por ejemplo, fines de diagnóstico o para estratificar a los pacientes para regímenes de tratamiento optimizados. La IHC también se utiliza ampliamente en la investigación, donde se analizan las moléculas de interés para estudiar sus funciones en las células y tejidos sanos y enfermos a nivel molecular, celular o tisular. Hay muchas maneras diferentes de realizar la visualización de las dianas en los tejidos utilizando la IHC o métodos basados en la IHC, y existen numerosos protocolos para diferentes aplicaciones y ensayos. Aunque la IHC es generalmente un método robusto y establecido, los nuevos ensayos a menudo necesitan una cuidadosa optimización dependiendo del tejido o de las propiedades de la proteína diana, la molécula aglutinante y/o el sistema reportero. Muchos años de desarrollo técnico y el enorme aumento de la disponibilidad de moléculas de unión específicas han mejorado enormemente la utilidad y las áreas de aplicación de la IHC. Los avances en el campo de las técnicas y los reactivos basados en la IHC han permitido a los científicos y a los profesionales de la salud disponer de herramientas, ensayos y biomarcadores más precisos. Además, los avances técnicos han permitido, por ejemplo, la detección simultánea de alta sensibilidad de múltiples proteínas en la misma muestra, y la detección de interacciones proteína-proteína (véase el ensayo de ligadura de proximidad).
El ensayo clásico de IHC se ilustra en la Figura 1 e implica la detección de epítopos expresados por una única proteína-objetivo dentro de una muestra de tejido utilizando un «anticuerpo primario» capaz de unirse a esos epítopos con alta especificidad. Después del evento de unión epítopo-anticuerpo, se añade un «anticuerpo secundario» capaz de unirse al anticuerpo primario con alta especificidad. El anticuerpo secundario se acopla a una molécula informadora y después del evento de unión anticuerpo-anticuerpo, se añade un sustrato químico que reacciona con la molécula informadora para producir un precipitado coloreado en el lugar del complejo epítopo-anticuerpo completo.
Figura 1. El principio básico de la inmunohistoquímica.
En la ilustración esquemática (Figura 1) se tiñe una sección de tejido fijada en formol e incrustada en parafina utilizando un anticuerpo primario dirigido hacia una diana proteica específica. Se añade una solución que contiene el anticuerpo primario a la sección de tejido y se deja que los anticuerpos tengan un tiempo para encontrar y unirse a su objetivo. Después de este paso, los anticuerpos no unidos y sobrantes se eliminan por lavado y se añade el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario, que lleva una molécula de enlace con enzimas de peroxidasa de rábano (HRP), también se deja un tiempo para que se una al anticuerpo primario, seguido de otro paso de lavado. A continuación, se añade 3,3′ Diaminobenzidina (DAB). La enzima HRP transforma el sustrato DAB en un precipitado de color marrón que se deposita en el tejido en el lugar de la reacción, produciendo así una representación visual del lugar en el que el anticuerpo primario se unió por primera vez a su diana.
Tecnología
Preparación del tejido
El tejido desempeña un papel central en el experimento y es importante que se procese de forma que se conserven los epítopos y la morfología adecuada. El procesamiento más común para la IHC es la preparación de bloques de tejido fijados en formalina e incluidos en parafina (FFPE). El propósito de la fijación con formalina es producir la reticulación química de las proteínas dentro del tejido. Esto pone fin a todos los procesos celulares y congela los componentes celulares en el lugar y en la conformación en que se encontraban en el momento de la fijación, además de evitar su degradación. Tras una fijación adecuada, el tejido se sigue procesando y, finalmente, se incrusta en bloques de parafina, que luego se seccionan en cortes finos (normalmente de 4 a 10 µm) utilizando un micrótomo. Las secciones se transfieren a portaobjetos de vidrio y se deja que se adhieran antes de su posterior procesamiento.
A veces se utilizan otros métodos de fijación además del formol. Estos incluyen otros tipos de aldehídos o el uso de diferentes soluciones de alcohol. La mejor elección del fijador depende en gran medida del ensayo. Una alternativa común a la FFPE es la preparación de muestras de tejido congeladas. En este caso, el tejido se incrusta en un medio crioprotector y se congela, y la fijación se realiza después del corte. Los tejidos congelados se seccionan en criostatos y tienen la ventaja de que los tiempos de procesamiento son cortos y de que se conservan mejor los epítopos sensibles, pero a menudo pueden ser inferiores a los tejidos FFPE en cuanto a la conservación de la morfología histológica.
Recuperación de antígenos (epítopos)
Una preocupación asociada a los fijadores de reticulación, como la formalina, o a un tiempo demasiado largo en el medio de fijación es el enmascaramiento de los epítopos, que puede impedir que el anticuerpo primario se una a su objetivo. Especialmente en el caso de las muestras FFPE, a menudo es necesario revertir parte de la reticulación química y «recuperar» los epítopos antes de proceder a la IHC propiamente dicha. Existen varios protocolos de recuperación de antígenos y las principales estrategias incluyen el tratamiento del portaobjetos con calor, enzimas digestivas, detergentes o combinaciones de los mismos. El método más común para la recuperación de antígenos en muestras FFPE es hervir a presión los portaobjetos de tejido en un tampón de citrato ácido durante unos 15-20 minutos.
Unión de anticuerpos
La calidad y especificidad de la molécula de unión es crucial para cualquier técnica basada en la IHC, y la elección del aglutinante puede afectar directamente al resultado, la fiabilidad y posiblemente también la interpretación del ensayo. Los anticuerpos son, con mucho, el tipo más común de molécula de unión utilizada para la IHC, y aunque la mayoría de los anticuerpos son capaces de detectar adecuadamente la molécula de interés correcta, también pueden variar mucho en su especificidad para su objetivo previsto. Los anticuerpos con alta especificidad son, por tanto, más fiables a la hora de interpretar la unión «on-target», ya que producen poca o ninguna unión «off-target» o «background». Los anticuerpos que son menos específicos pueden producir más uniones fuera del objetivo, y el fondo resultante posiblemente interferirá con la interpretación correcta de las verdaderas señales en el objetivo. Hay dos tipos principales de anticuerpos: los policlonales, que son una mezcla heterogénea de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de la diana, y los monoclonales, que se unen al mismo epítopo. Los anticuerpos policlonales suelen ser muy potentes debido a su capacidad para detectar y unirse a múltiples epítopos de la misma diana. Sin embargo, los epítopos a los que se unen no suelen estar bien definidos y, con la especificidad múltiple y variable de los epítopos, aumenta la probabilidad de que se produzcan eventos de unión fuera del objetivo y ruido de fondo. Sin embargo, la potencia de los anticuerpos policlonales puede ser ventajosa, ya que la concentración de eventos de unión en torno a la molécula objetivo suele superar el posible ruido de fondo. Una desventaja es que los anticuerpos policlonales suelen ser recursos limitados, ya que se derivan de sueros animales. Los anticuerpos monoclonales, por el contrario, tienen más continuidad, ya que pueden producirse en líneas celulares de hibridoma. Los anticuerpos monoclonales también suelen estar bien definidos en cuanto a la unión del epítopo, pero aún así pueden generar resultados difíciles de interpretar si la especificidad es baja o si el epítopo diana está presente en baja abundancia.
Se necesita una cuidadosa optimización y titulación de la concentración de anticuerpos para cada ensayo, ya que el resultado depende no sólo de la especificidad y afinidad del anticuerpo por la diana, sino también de la concentración y disponibilidad de los epítopos on-target y off-target potenciales presentes en la muestra. Si se añaden demasiados anticuerpos a la muestra, aumentará el número de posibles eventos de unión fuera de la diana de baja afinidad, una vez que el epítopo o epítopos de la diana estén saturados de ligantes. Al reducir la concentración de anticuerpos, los eventos de unión fuera del objetivo se vuelven más raros, ya que suelen tener menor afinidad que los eventos de unión en el objetivo. El riesgo cuando se intenta reducir el fondo mientras se utiliza un anticuerpo de baja afinidad es que las señales on-target se debilitan concomitantemente hasta el punto de proporcionar un resultado falso negativo.
Otros tipos de moléculas aglutinantes que se utilizan a veces en las técnicas basadas en la IHC incluyen afibiodes, péptidos, fragmentos de anticuerpos u otras moléculas pequeñas.
Sistemas de detección
El objetivo de realizar la IHC es obtener una representación visual de dónde puede encontrarse la diana dentro del tejido experimental, y preferiblemente también obtener información sobre el patrón de expresión de la diana entre poblaciones celulares heterogéneas y/o localizaciones subcelulares. Esto se ejemplifica en la Figura 2, que ilustra cómo se utilizan diferentes anticuerpos para visualizar diferentes compartimentos celulares o tisulares dentro de un tejido complejo. Para visualizar la interacción diana-anticuerpo, se necesita algún tipo de sistema de detección que produzca una mancha o señal observable. El método más común para introducir un sistema de detección en el experimento es utilizar un anticuerpo secundario que lleve una molécula reportera preunida, es decir, una enzima o un fluoróforo. Los anticuerpos secundarios suelen estar dirigidos específicamente a moléculas de anticuerpos de una especie animal diferente. Por ejemplo, si el anticuerpo primario se cría en un conejo, entonces el anticuerpo secundario debe criarse en otro animal y dirigirse específicamente hacia anticuerpos de conejo.
| Esófago | Ampliación | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Tinción con hematoxilina | Sin tinción con anticuerpos | ||||
| TP63 CAB000083 |
Tinción nuclear | ||||
| Tinción membranosa | |||||
| G6PD HPA000247 |
Tinción de la célula de la sangre | Tinción citoplasmática | |||
| LAMB2 (Laminina) CAB000053 |
Tejido conectivo |
Figura 2. Visualización de diferentes objetivos proteicos en tejidos complejos. La columna de la derecha muestra una ampliación de las imágenes correspondientes de la columna de la izquierda.
En la imagen IHC (Figura 2), secciones consecutivas de esófago humano teñidas con cuatro anticuerpos diferentes permiten comparar directamente diferentes patrones de expresión de proteínas dentro del tejido y dentro de compartimentos subcelulares. Las imágenes superiores sólo están teñidas con hematoxilina para su comparación. El anticuerpo p63 tiñe los núcleos celulares en una población de células que residen en la parte basal del epitelio esofágico. El anticuerpo EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) parece teñir la misma población celular que p63, pero tiñe las membranas celulares en lugar de los núcleos. El anticuerpo G6PD (glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) tiñe el citoplasma de un repertorio más amplio de células epiteliales esofágicas y también de células que residen en el tejido conectivo. El anticuerpo contra la laminina (LAMB2) tiñe sólo las células y estructuras del tejido conectivo subyacente al esófago.
Para las muestras de tejido FFPE, el método de detección más común es utilizar reacciones enzimáticas para generar un precipitado coloreado en el lugar de unión del anticuerpo. Los anticuerpos secundarios llevan entonces una enzima, por ejemplo la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP), que son capaces de convertir cromógenos como la 3,3′ Diaminobencidina (DAB) o el 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/cloruro de p-nitroazul tetrazolio (BCIP/NBT) en precipitados marrones o azulados que se depositan en el tejido en el lugar de la reacción. Las tinciones cromogénicas son observables en microscopía de luz y suelen ser muy estables durante largos periodos de tiempo, lo cual es beneficioso si el experimento debe archivarse o revisarse en un momento posterior.
Para las secciones de tejido congeladas es más común utilizar anticuerpos secundarios ligados a fluoróforos que emiten un color específico (normalmente verde, rojo o azul) cuando son excitados por las longitudes de onda de luz correctas. Además, los fluoróforos no suelen ser estables durante largos periodos de tiempo. Sin embargo, la ventaja de utilizar fluoróforos es que proporcionan un método fácil para realizar experimentos de doble etiquetado en los que se analizan varios anticuerpos contra múltiples objetivos en la misma muestra. Los anticuerpos secundarios deben dirigirse a diferentes anticuerpos primarios y también acoplarse a diferentes fluoróforos. Los diferentes anticuerpos secundarios se observan por separado excitándolos secuencialmente con diferentes longitudes de onda de luz. Estos resultados de excitación diferentes se guardan como imágenes separadas (o canales de color) y pueden superponerse posteriormente para inferir co-localizaciones de proteínas, etc.
El uso de anticuerpos secundarios portadores de reporteros para la detección es en sí mismo un paso de amplificación, ya que varios anticuerpos secundarios son capaces de unirse a un solo anticuerpo primario, pero a veces se desean otros pasos de amplificación para aumentar la señal y la sensibilidad del experimento. En estos casos, el anticuerpo secundario puede llevar «moléculas enlazadoras», por ejemplo, polímeros de biotina, que son capaces de reclutar un mayor número de moléculas informadoras en los pasos posteriores. Esta estrategia de amplificación de las señales es útil tanto para los métodos de detección enzimáticos como fluorescentes.
Contaminación
La tinción inmunohistoquímica con cromógenos se beneficia a menudo de la aplicación de una contratinción que aumenta el contraste y facilita la observación de las características histológicas. El tipo de contratinción más comúnmente utilizado para las muestras FFPE es la hematoxilina que tiñe el citoplasma celular con un color azulado pálido, y tiñe los núcleos celulares con un matiz azulado más oscuro. Las tinciones fluorescentes no suelen teñirse con hematoxilina, ya que el método de detección no se basa en la microscopía de luz. En su lugar, la forma más común de obtener la contratinción para la fluorescencia es etiquetar los núcleos celulares añadiendo tintes fluorescentes que se unen a los ácidos nucleicos. Después de la reacción inmunohistoquímica propiamente dicha, los únicos pasos que quedan son cubrir y sellar la muestra para protegerla y almacenarla a largo plazo. La forma más habitual es «pegar» el cubreobjetos a la muestra utilizando resinas comercialmente disponibles para tal fin.
Ejemplos específicos
La IHC se utiliza ampliamente tanto en la investigación como en la práctica clínica. El proyecto Human Protein Atlas (HPA) es un excelente ejemplo de cómo se utiliza la IHC de alto rendimiento para lograr un mapeo a gran escala del proteoma humano en una multitud de tejidos, cánceres y células. En el proyecto HPA, una cadena interna de producción de anticuerpos a gran escala facilita la generación de anticuerpos específicos que, tras pasar por los regímenes básicos de caracterización y validación, se utilizan para teñir sistemáticamente microarrays de tejidos que contienen cientos de núcleos de tejidos en un solo experimento. El sistema de IHC empleado por HPA se basa en gran medida en la estandarización de los protocolos y la automatización mediante máquinas, pero la evaluación de la titulación óptima para cada anticuerpo se realiza manualmente antes de que el anticuerpo sea aprobado para la tinción en el conjunto de tejidos. Cada núcleo de tejido teñido se anota con respecto a la tinción inmunohistoquímica en los tejidos y los tipos de células, y posteriormente se publica como imagen de alta resolución en el portal web para que cualquiera pueda verla libremente.
En la práctica clínica, la IHC se utiliza principalmente dentro de la patología para ayudar a los médicos a evaluar las muestras de tejido con respecto a los estados sanos y o enfermos, para establecer diagnósticos, y para definir el subtipo molecular de los diferentes tipos de cáncer. Un ejemplo específico en el que la IHC se utiliza para el diagnóstico es cuando los patólogos reciben una muestra de un tumor metastásico y se desconoce el origen del tejido del tumor primario. En estos casos, los patólogos utilizan un panel de diferentes anticuerpos dirigidos a proteínas específicas del tejido, como el antígeno específico de la próstata para el cáncer de próstata, o el receptor de estrógeno para los cánceres ginecológicos, o la citoqueratina 20 para los cánceres gastrointestinales (Gremel et al., 2014). Una vez que se ha hecho una clasificación amplia, se utilizan anticuerpos adicionales específicos del tejido para precisar aún más el origen del tumor primario. Esta información es útil para elegir la mejor estrategia o la más adecuada para el tratamiento farmacológico y/o para localizar el tumor primario para la radioterapia y/o la cirugía.
Referencias y enlaces
Anticuerpos comúnmente utilizados para el diagnóstico del cáncer:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopatología. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Una revisión sobre la validación de anticuerpos para IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Una base de datos de acceso abierto de anticuerpos disponibles públicamente y su utilidad en diversas aplicaciones:
El mundo de la IHC – Protocolos, foro, productos y más:
Un clip de YouTube que ilustra la IHC de BioGenexLaboratories: