00:00:07.25Hola, mi nombre es Jennifer Doudna de la UC Berkeley
00:00:09.26y estoy aquí hoy para contarles cómo descubrimos
00:00:12.26una nueva tecnología de ingeniería del genoma.
00:00:15.07Esta historia comienza con un sistema inmunitario bacteriano
00:00:20.12que significa entender cómo las bacterias
00:00:22.14luchan contra una infección vírica.
00:00:24.26Resulta que muchas bacterias
00:00:28.04tienen en su cromosoma,
00:00:30.09que es lo que están viendo aquí
00:00:32.15una secuencia de repeticiones que se muestran en estos diamantes negros
00:00:36.18que están intercalados con secuencias
00:00:40.19que derivan de virus
00:00:43.08y que han sido detectadas por microbiólogos
00:00:46.20que estaban secuenciando genomas bacterianos, pero nadie sabía
00:00:50.10cuál podría ser la función de estas secuencias
00:00:53.06hasta que se observó que estaban intercaladas con secuencias
00:00:40.06hasta que se observó que tienden a aparecer también
00:00:58.09con una serie de genes que suelen codificar proteínas
00:01:03.29que tienen homología con enzimas que hacen cosas interesantes
00:01:09.03como la reparación del ADN.12 Así que era una hipótesis que este sistema
00:01:14.04que llegó a llamarse CRISPR
00:01:16.08que es un acrónimo para este tipo de locus repetitivos
00:01:19.14que estos sistemas CRISPR podrían ser en realidad
00:01:22.29un sistema inmunitario adquirido en las bacterias
00:01:26.00que podría permitir integrar secuencias
00:01:29.06de virus y utilizarlas de algún modo posteriormente
00:01:32.07para proteger a la célula de una infección
00:01:35.26con ese mismo virus.
00:01:37.05Así que esta era una hipótesis interesante
00:01:39.11y nos pusimos a estudiar esto
00:01:41.18a mediados de la década de 2000, justo después de la publicación
00:01:44.15de tres artículos que señalaban
00:01:47.13la incorporación de secuencias virales
00:01:50.00en estos loci genómicos.
00:01:52.07Y lo que surgió en los años siguientes
00:01:55.17fue que, de hecho, estos sistemas CRISPR
00:01:58.08realmente son sistemas inmunes adquiridos en las bacterias
00:02:01.18así que hasta ese momento nadie sabía que las bacterias
00:02:04.24podrían tener una forma de adaptarse
00:02:08.08a los virus que entran en la célula
00:02:10.29pero esta es una forma de hacerlo
00:02:12.14y consiste en detectar el ADN extraño
00:02:15.17que se inyecta como se muestra en este ejemplo
00:02:18.04de un virus que entra en la célula
00:02:20.07el sistema CRISPR permite la integración
00:02:26.06de trozos cortos de esas moléculas de ADN viral
00:02:29.15en el locus CRISPR
00:02:31.07y luego, en el segundo paso
00:02:33.27que se muestra aquí como biogénesis del ARN CRISPR
00:02:38.20estas secuencias CRISPR se transcriben
00:02:42.20en la célula en trozos de ARN
00:02:45.15que posteriormente se utilizan junto
00:02:48.23con proteínas codificadas por los genes CAS
00:02:52.09estos genes asociados a CRISPR
00:02:54.01para formar complejos de interferencia
00:02:58.12que pueden utilizar la información en forma
00:03:01.17de estas moléculas de ARN para emparejarse
00:03:04.08con secuencias coincidentes en el ADN viral.
00:03:07.18Así que una forma muy ingeniosa que las bacterias
00:03:10.12han ideado para coger a sus invasores
00:03:13.06y volver la información de la secuencia contra ellos.
00:03:17.00Así que en mi propio laboratorio
00:03:20.21estamos muy interesados desde hace tiempo
00:03:23.09en comprender cómo las moléculas de ARN
00:03:26.03se utilizan para ayudar a las células a averiguar
00:03:32.00cómo regular la expresión de las proteínas
00:03:34.03del genoma.
00:03:35.05Así que esto nos pareció también un ejemplo muy interesante
00:03:37.27de esto y
00:03:39.18empezamos a estudiar los mecanismos moleculares básicos
00:03:42.24por los que funciona esta vía.
00:03:45.01Y en 2011 fui a una conferencia científica
00:03:49.23y conocí a una colega mía,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier que aparece en esta foto
00:03:56.10en el extremo izquierdo y el laboratorio de Emmanuelle
00:03:58.14trabaja en problemas de microbiología y están
00:04:02.11particularmente interesados en las bacterias
00:04:04.00que son patógenos humanos.
00:04:06.01Estaba estudiando un organismo llamado
00:04:08.03Streptococcus pyogenes que es una bacteria
00:04:11.15que puede causar infecciones muy graves en humanos
00:04:14.25y lo curioso de este bicho era que
00:04:16.25tiene un sistema CRISPR y en ese organismo
00:04:19.06Había un único gen que codificaba una proteína
00:04:21.27conocida como Cas9
00:04:23.12que se había demostrado genéticamente que era necesaria
00:04:26.09para la función del sistema CRISPR
00:04:28.16en Streptococcus pyogenes,
00:04:30.23pero nadie sabía en ese momento cuál era la función
00:04:33.05de esa proteína.
00:04:34.20Así que nos reunimos y reclutamos a
00:04:37.20personas de nuestros respectivos laboratorios de investigación
00:04:40.26para empezar a probar la función de Cas9.
00:04:43.17Así que las personas clave del proyecto
00:04:45.20se muestran aquí en la fotografía
00:04:48.00en el centro está Martin Jinek
00:04:50.03que es un asociado postdoctoral en mi propio laboratorio
00:04:52.17y a su lado, con la camisa azul
00:04:54.22es Kryztof Chylinski, que fue estudiante
00:04:57.20en el laboratorio de Emmanuelle
00:04:58.26y, por tanto, estos dos chicos junto con
00:05:00.21Ines Fonfara, que está en el extremo derecho,
00:05:02.10un posdoctorado con Emmanuelle
00:05:04.01empezaron a hacer experimentos al otro lado del Atlántico
00:05:07.25y a compartir sus datos.
00:05:10.09Y lo que descubrieron fue que
00:05:13.06Cas9 es en realidad una proteína fascinante
00:05:16.04que tiene la capacidad de interactuar con el ADN
00:05:19.28y generar una rotura de doble cadena
00:05:22.02en el ADN en secuencias que coinciden
00:05:25.06con la secuencia de un ARN guía
00:05:27.08y en esta diapositiva lo que se ve
00:05:29.06es que el ARN guía
00:05:30.10y la secuencia de la guía en naranja
00:05:32.11se empareja con una hebra
00:05:34.18del ADN de doble hélice
00:05:37.11y, lo que es muy importante, este ARN
00:05:39.28interactúa con una segunda molécula de ARN
00:05:42.09llamada tracr que forma una estructura
00:05:46.03que recluta a la proteína Cas9
00:05:47.29por lo que esos dos ARN y una sola proteína
00:05:50.13en la naturaleza son los que se requieren
00:05:52.23para que esta proteína reconozca
00:05:56.05lo que normalmente serían ADNs virales
00:05:58.11en la célula y la proteína
00:06:01.13es capaz de cortarlos,
00:06:02.14literalmente rompiendo el ADN de doble hélice.
00:06:05.24Y así, cuando descubrimos esto
00:06:08.14pensamos: ¿no sería asombroso
00:06:10.26si pudiéramos generar un sistema más sencillo
00:06:13.29como lo ha hecho la naturaleza
00:06:15.02al unir estas dos moléculas de ARN
00:06:18.04para generar un sistema que fuera una sola proteína
00:06:20.16y un solo ARN guía.28 Así que la idea era básicamente tomar
00:06:25.17estos dos ARN que se ven en el extremo
00:06:29.29de la diapositiva y luego básicamente unirlos
00:06:33.19para crear lo que llamamos
00:06:35.04un único ARN guía.
00:06:36.22 Así que Martin Jinek, en el laboratorio
00:06:38.25, hizo esa construcción
00:06:40.21 e hicimos un experimento muy sencillo
00:06:44.22 para comprobar si realmente teníamos
00:06:46.18una enzima programable de corte de ADN
00:06:49.29y la idea era generar ARN guía cortos
00:06:54.04que reconocieran diferentes sitios en una molécula de ADN circular
00:06:59.24que se ve aquí
00:07:00.21y los ARN guía se diseñaron
00:07:03.10para reconocer las secuencias mostradas por las barras rojas
00:07:06.17en la diapositiva y el experimento consistió en
00:07:10.16tomar ese plásmido, esa molécula de ADN circular
00:07:13.21e incubarla con dos enzimas de restricción (o de corte) diferentes,
00:07:18.27una llamada SalI, que corta
00:07:21.23el ADN en el extremo
00:07:25.05del ADN en esta imagen
00:07:26.12en el cuadro gris,
00:07:27.19y el segundo sitio dirigido
00:07:31.00por el ARN guiado por Cas9
00:07:33.13en estos sitios diferentes que se muestran en rojo.
00:07:35.16Y un experimento muy sencillo
00:07:37.19hicimos esta reacción de incubación
00:07:39.26con ADN plasmídico y este es el resultado
00:07:43.24y esto es lo que estás viendo
00:07:45.28es un gel de agarosa
00:07:47.29que nos permite separar
00:07:49.16las moléculas de ADN escindidas
00:07:51.20y lo que se puede ver es que en cada uno de estos carriles de reacción
00:07:54.22obtenemos una molécula de ADN de diferente tamaño liberada
00:07:58.12de este plásmido doblemente digerido
00:08:00.16en el que el tamaño del ADN
00:08:03.29corresponde a la escisión en los diferentes sitios
00:08:06.11dirigidos por estas secuencias de ARN guía
00:08:08.26indicadas en rojo
00:08:10.24por lo que fue un momento realmente emocionante
00:08:12.29en realidad un experimento muy sencillo que fue
00:08:15.15como un momento de «¡Ajá!»
00:08:17.03cuando dijimos que realmente teníamos una enzima programable para cortar el ADN
00:08:22.02y que podíamos programarla con un trozo corto de ARN
00:08:24.15para cortar esencialmente cualquier secuencia de ADN de doble cadena
00:08:28.07Así que la razón por la que estábamos tan entusiasmados
00:08:30.23sobre una enzima que puede ser programada
00:08:33.19para generar roturas de ADN de doble cadena
00:08:36.01en cualquier secuencia es porque
00:08:39.00hay un conjunto de experimentos de larga data
00:08:42.16en la comunidad científica que demostró
00:08:45.13que las células tienen formas de reparar las roturas de doble cadena en el ADN
00:08:49.26que conducen a cambios
00:08:52.02en la información genómica del ADN
00:08:55.21así que esta es una diapositiva que muestra que
00:08:58.20después de que se genere una rotura de doble cadena
00:09:01.14por cualquier tipo de enzima que pueda hacer esto
00:09:04.13incluyendo el sistema Cas9
00:09:06.05esas roturas de doble cadena en una célula
00:09:09.07se detectan y reparan mediante dos tipos de vías
00:09:13.15una a la izquierda que implica
00:09:17.26la unión de extremos no homólogos
00:09:20.07en la que los extremos del ADN se ligan químicamente
00:09:24.07de nuevo, normalmente con la introducción
00:09:26.18de una pequeña inserción o deleción
00:09:28.25en el lugar de la ruptura
00:09:29.27y a la derecha
00:09:32.01es otra forma de reparación
00:09:34.00mediante la reparación dirigida por homología
00:09:37.22en la que una molécula de ADN donante
00:09:39.14que tiene secuencias que coinciden con las
00:09:43.28que flanquean el lugar de la
00:09:45.12ruptura de doble cadena puede integrarse
00:09:48.05en el genoma en el lugar
00:09:50.10de la ruptura para introducir nueva información genética
00:09:54.06en el genoma
00:09:55.15 Así que esto había dado a muchos científicos
00:09:59.04la idea de que si existiera una herramienta
00:10:01.04o una tecnología que permitiera
00:10:03.05a los científicos o investigadores introducir
00:10:06.12roturas de doble cadena en sitios específicos
00:10:09.00en el ADN de una célula, entonces, junto
00:10:12.12con todos los datos de secuenciación del genoma
00:10:14.21que ahora están disponibles, conocemos la
00:10:16.10secuencia genética completa de una célula
00:10:18.21y si supiéramos dónde se ha producido una mutación
00:10:21.20que provoca una enfermedad, por ejemplo
00:10:23.20podríamos utilizar una tecnología como ésta
00:10:26.25para introducir el ADN que corregiría una mutación
00:10:31.00o generar una mutación
00:10:32.23 que se quiera estudiar en un entorno de investigación
00:10:35.04así que el poder de esta tecnología es
00:10:38.28realmente la idea de que ahora podemos generar
00:10:41.20este tipo de roturas de doble cadena
00:10:43.17en sitios que elegimos como científicos
00:10:46.17programando a Cas9 y luego permitir
00:10:48.13que la célula haga reparaciones que introduzcan
00:10:51.04cambios genómicos en los sitios de estas roturas
00:10:54.15Pero el reto consistía en cómo generar las roturas
00:10:58.11en primer lugar, por lo que se habían producido varias
00:11:00.09de diferentes estrategias
00:11:03.24para hacer esto en diferentes laboratorios
00:11:05.15La mayoría de ellas, y voy a mostrar
00:11:08.21dos ejemplos concretos
00:11:10.17una llamada nucleasas de dedos de zinc
00:11:12.25y la otra de dominios efectores TAL
00:11:15.02son formas programables
00:11:18.08para generar roturas de doble cadena en el ADN
00:11:20.21que se basan en el reconocimiento basado en proteínas
00:11:23.29de secuencias de ADN, por lo que se trata de proteínas
00:11:26.06que son modulares y pueden generarse
00:11:29.12en diferentes combinaciones de módulos
00:11:31.22para reconocer diferentes secuencias de ADN
00:11:34.03funciona como una tecnología
00:11:37.18pero requiere mucha ingeniería de proteínas
00:11:40.24para hacerlo, y lo que es realmente emocionante
00:11:43.16de esta enzima CRISPR/Cas9
00:11:46.11es que se trata de una proteína programada por ARN
00:11:49.25por lo que se puede utilizar una sola proteína para
00:11:52.09cualquier sitio del ADN en el que
00:11:54.27queramos generar una rotura
00:11:56.13simplemente cambiando la secuencia
00:11:58.16del ARN guía asociado a Cas9
00:12:00.24así que en lugar de confiar en el reconocimiento basado en proteínas
00:12:03.06del ADN nos basamos en
00:12:06.04el reconocimiento del ADN basado en el ARN
00:12:08.26como se muestra en la parte inferior, así que lo que esto significa
00:12:11.03es que es simplemente un sistema
00:12:12.18que es lo suficientemente sencillo de utilizar
00:12:15.15que cualquiera con formación básica en biología molecular
00:12:19.05pueda aprovechar este sistema
00:12:20.29para hacer ingeniería del genoma
00:12:22.20y, por tanto, se trata de una herramienta que realmente
00:12:26.06creo que completa un componente esencial
00:12:29.03y que antes faltaba
00:12:30.24de lo que podríamos llamar la caja de herramientas informáticas de la biología
00:12:33.29que incluye no sólo la capacidad
00:12:36.00de secuenciar el ADN y observar
00:12:38.06su estructura, que conocemos
00:12:39.24de la doble hélice desde la década de 1950
00:12:42.00y luego, en las últimas décadas
00:12:44.18se han podido utilizar enzimas
00:12:46.09como las enzimas de restricción
00:12:47.26y la reacción en cadena de la polimerasa
00:12:49.09para aislar y amplificar segmentos concretos
00:12:52.19de ADN y ahora con Cas9
00:12:55.10tenemos una tecnología que permite
00:12:57.15la ingeniería genómica fácil
00:12:59.13que está a disposición de los laboratorios de todo el mundo
00:13:03.07para los experimentos que quieran hacer
00:13:05.08y este es un resumen de la tecnología
00:13:10.11del sistema de 2 componentes
00:13:11.29que se basa en el emparejamiento de bases de ARN-ADN
00:13:14.16para el reconocimiento
00:13:15.21y, lo que es muy importante, por la forma
00:13:18.24que este sistema funciona
00:13:19.28es en realidad bastante sencillo
00:13:21.18hacer algo llamado multiplexación
00:13:24.20que significa que podemos programar Cas9
00:13:27.00con múltiples ARNs guía diferentes
00:13:28.23en la misma célula para generar
00:13:30.19múltiples roturas y hacer cosas
00:13:32.06como cortar grandes segmentos de un cromosoma
00:13:35.01y simplemente eliminarlos en un solo experimento.
00:13:38.25Y esto ha provocado una verdadera explosión
00:13:42.03en el campo de la biología y la genética
00:13:45.19con muchos laboratorios de todo el mundo
00:13:48.08adoptando esta tecnología
00:13:49.25para todo tipo de aplicaciones muy interesantes
00:13:51.15y creativas
00:13:53.13y esta es una diapositiva
00:13:54.24que, en realidad, ya está casi desfasada
00:13:56.11pero para que se hagan una idea
00:13:57.14de la forma en que el campo
00:14:00.07ha despegado
00:14:01.08así que publicamos nuestro trabajo original sobre Cas9
00:14:04.10en 2012 y hasta ese momento
00:14:07.16había muy poca investigación
00:14:08.18sobre la biología de CRISPR en cualquier lugar
00:14:11.12era un campo muy pequeño
00:14:12.19y luego puedes ver que
00:14:13.27a partir de 2013 y se extiende
00:14:16.09hasta ahora ha habido esta
00:14:17.21increíble explosión de publicaciones
00:14:20.16de los laboratorios que están utilizando
00:14:22.09esto como una tecnología de ingeniería del genoma
00:14:24.01así que ha sido muy emocionante para mí
00:14:26.25como científico básico ver que lo que empezó
00:14:29.22como un proyecto de investigación fundamental
00:14:31.12se ha convertido en una tecnología que resulta
00:14:34.08muy útil para todo tipo
00:14:35.28de emocionantes experimentos
00:14:37.07y sólo quería terminar compartiendo
00:14:40.07con ustedes algunas cosas
00:14:42.17que se están llevando a cabo utilizando esta tecnología
00:14:44.17así que, por supuesto, a la izquierda
00:14:47.13mucha biología básica que se puede hacer ahora
00:14:50.02con la ingeniería de organismos modelo
00:14:53.03y diferentes tipos de líneas celulares
00:14:55.02que se cultivan en el laboratorio
00:14:56.21para estudiar el comportamiento de las células
00:14:58.13pero también en biotecnología al poder
00:15:01.23realizar cambios selectivos en plantas
00:15:05.15y varios tipos de hongos que podrían ser muy
00:15:07.11útiles para diferentes tipos de aplicaciones industriales
00:15:09.29y luego, por supuesto, en biomedicina
00:15:12.14con mucho interés en el potencial
00:15:14.14de utilizar esta tecnología como herramienta
00:15:17.03para conseguir realmente nuevas terapias
00:15:21.06para enfermedades humanas, creo que es algo
00:15:23.09que es muy emocionante y es realmente algo
00:15:26.05que ya está en el horizonte
00:15:27.09y luego esta diapositiva sólo indica
00:15:30.20donde creo que vamos a ver que esto va
00:15:33.15 en el futuro con una gran cantidad de interesantes
00:15:36.20y creativos tipos de direcciones
00:15:39.03que están surgiendo en diferentes laboratorios
00:15:41.02tanto en los laboratorios de investigación académica
00:15:43.19pero también cada vez más en los laboratorios comerciales
00:15:45.29que van a permitir el uso de esta
00:15:49.24tecnología para todo tipo de aplicaciones
00:15:52.18muchas de las cuales ni siquiera podríamos haber
00:15:54.10imaginado hace dos años.
00:15:56.05Así que es muy emocionante y quiero reconocer a un gran equipo
00:16:01.10de personas que han participado en el proyecto conmigo y hemos
00:16:06.07tenido un gran apoyo financiero de varios grupos
00:16:11.00también y ha sido un placer
00:16:13.00compartir esto con ustedes, gracias.