Fronteras en Oncología

Introducción

Se sabe que la infección persistente por el virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH-h) es una causa necesaria para el cáncer de cuello uterino y las lesiones precancerosas (1, 2). Con una etiología revelada, el cáncer cervical es altamente prevenible (3, 4). Los países desarrollados han comenzado a utilizar la prueba del VPH-h en el cribado primario del cáncer de cuello uterino, ya sea sola o junto con la citología (5-8). Las pruebas demuestran que los programas de cribado basados en el VPH proporcionan una mayor protección contra el precáncer y el cáncer de cuello uterino que otros métodos de cribado tradicionales, como la citología (9-11). Sin embargo, dado que la mayoría de las infecciones por VPH podrían eliminarse espontáneamente, la prueba del VPH identifica numerosas infecciones que no progresarán a precáncer o cáncer cervical, especialmente en mujeres jóvenes (12). Por lo tanto, no se recomienda realizar la prueba del ADN del VPH en las mujeres menores de 30 años. Además, las pacientes positivas al VPH remitidas para procedimientos posteriores pueden sufrir intervenciones invasivas innecesarias.

En China, hubo 98 900 casos nuevos y 30 500 muertes por cáncer de cuello uterino en 2015 (13). Para frenar la tendencia creciente de esta neoplasia, el gobierno chino ha proporcionado un programa de cribado de cáncer cervical gratuito en todo el país para las mujeres que viven en zonas rurales desde 2009, utilizando la IVA/VIOL, la prueba de Papanicolaou (Pap) o la prueba del VPH (en sitios piloto), en función de los niveles de desarrollo económico y tecnológico (14). Sin embargo, debido a la naturaleza de estos métodos de cribado, es necesario mejorar la precisión del diagnóstico. Además, teniendo en cuenta la gran población de China, deben evaluarse nuevas herramientas de cribado con un equilibrio entre la sensibilidad y la especificidad.

Los marcadores moleculares específicos de la enfermedad del cáncer de cuello uterino proporcionan una combinación de alta sensibilidad y alta especificidad para detectar el precáncer de cuello uterino. La mayoría de estos marcadores se identificaron basándose en el mecanismo de carcinogénesis relacionado con el VPH. La prueba del ARN del VPH se basa en la detección del ARNm del VPH-AR E6 y E7. El potencial oncogénico de la infección por VPH depende de la producción de oncoproteínas virales E6/E7. Por lo tanto, la detección de los transcritos de ARNm E6/E7 ofrece la posibilidad de una prueba específica para detectar lesiones precancerosas.

En este estudio, se evaluó el rendimiento clínico de la prueba de ARNm del VPH E6/E7 para detectar la neoplasia intraepitelial cervical (NIC) de alto grado y el cáncer entre las mujeres chinas.

Materiales y métodos

Participantes y procedimientos

Este estudio basado en el hospital se llevó a cabo durante abril a diciembre de 2017 en la provincia de Henan, China. Se invitó a las mujeres que visitaron el departamento de ginecología de The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) para la colposcopia. Los criterios de inclusión fueron los siguientes (1) mujeres con edades comprendidas entre los 25 y los 64 años; (2) sin antecedentes de cáncer de cuello uterino o histerectomía; (3) sin síntomas clínicos de embarazo o 8 semanas después de la interrupción del mismo; y (4) entender los procedimientos del estudio y participar voluntariamente. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) del Hospital del Cáncer de Henan (HCH). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante.

Las células exfoliadas del cuello uterino se obtuvieron de las mujeres durante el examen ginecológico. La muestra se conservó en 20 ml de medio de transporte PreservCyt® (Hologic Inc., Marlborough, MA, Estados Unidos) y se almacenó a 4 °C. A continuación, un ginecólogo realizó una colposcopia. Las mujeres con resultados anormales en la colposcopia fueron sometidas a una biopsia dirigida a la lesión. Si el examen colposcópico era insatisfactorio (la unión escamocolumnar no era completamente visible), se realizaba un legrado endocervical (LEC). Las muestras de células exfoliadas del cuello uterino se transportaron al Instituto y Hospital del Cáncer de la Academia China de Ciencias Médicas (CICAMS). Las muestras se dividieron en dos porciones: una mezcla de células de 1,5 ml en un tubo EP para la prueba de ADN del VPH-AR y la prueba de ARNm del VPH E6/E7. El residuo con células exfoliadas se utilizó para la prueba citológica ThinPrep (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, Estados Unidos). Se utilizó el sistema de informes Bethesda para la citología por parte de un citólogo senior (15).

Análisis de ADN del VPH-AR

Las muestras de 400 μl de mezcla de células de tubos EP de 1,5 ml se utilizaron para la detección de ADN de 14 tipos de VPH-AR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68) mediante el ensayo Cobas 4800 HPV (Roche, Basilea, SUI). Informó del resultado agrupado de las 14 hrHPV, y del resultado separado para HPV 16 y 18, simultáneamente (16). El Cobas 4800 era una prueba basada en la PCR para el ADN del VPH con amplificación por hibridación de ácidos nucleicos según las instrucciones del fabricante. Se establecieron controles de calidad negativos y positivos en cada prueba. Si el valor ct era superior a 40, el resultado se consideraba negativo. En caso contrario, el resultado era positivo. Los resultados positivos incluían tres tipos: VPH 16, VPH 18 y VPH otros (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68).

Pruebas de ARNm del VPH E6/E7

Se utilizaron muestras de un ml de tubos EP de 1,5 ml para la detección del ARNm viral E6/E7 de los tipos de VPH de 14 horas en la prueba APTIMA HPV agregada (Hologic Inc, Marlborough, MA, Estados Unidos), según las instrucciones del fabricante (17). Se trataba de una prueba de tres pasos, que incluía la extracción del ARNm, la amplificación y la detección del producto amplificado. Si el número de copias era mayor o igual a 1,0, el resultado se consideraba positivo. En caso contrario, el resultado era negativo.

Diagnóstico histopatológico

Las biopsias y los tejidos del LEC se enviaron a la SAHZU para el diagnóstico histopatológico de acuerdo con el sistema de notificación de la neoplasia intraepitelial cervical (NIC). A continuación, los histopatólogos del HCH revisaron todos los portaobjetos. Cualquier diagnóstico patológico incoherente se envió a CICAMS para su adjudicación. El diagnóstico final para cada mujer se basó en la peor lectura de la revisión del panel. Todo el proceso de detección y diagnóstico fue ciego.

Análisis estadístico

El diagnóstico histopatológico final se utilizó como patrón de oro. Las mujeres con diagnóstico de TCT de la lesión escamosa intraepitelial de bajo grado (LSIL) o peor (LSIL +) se consideraron positivas a la citología de base líquida (LBC). Los resultados del ADN del VPH se estratificaron según los tipos de VPH: VPH16/18 (es decir, VPH16 y/o VPH18 positivos), VPH-otros (es decir, cualquiera de los 12 tipos de VPH positivos excluyendo el VPH16 y el VPH18), y VPH-total (es decir, cualquiera de los 14 tipos de VPH positivos). Se calcularon las estimaciones absolutas y los intervalos confidenciales del 95% (IC 95%) de las tasas positivas, la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN). Las diferencias en las expresiones de ARNm del VPH en los distintos grupos de VPH se calcularon mediante la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Se utilizó la prueba de McNemar para identificar las diferencias de sensibilidad y especificidad. El nivel α se fijó en 0,05, y p < 0,05 (tamaño dos) se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

En total, se incluyeron 537 mujeres en este análisis. La edad media fue de 43,88 ± 10,97 años. Los diagnósticos de LBC fueron: 183 (34,7%) normales, 135 (25,1%) células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US), 22 (4,1%) células escamosas atípicas no pueden excluir HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) células glandulares atípicas (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) lesión intraepitelial escamosa de alto grado (HSIL), 31 (5,8%) carcinomas de células escamosas (SCC) y 2 (0,4%) adenocarcinoma in situ (AIS). Los diagnósticos histopatológicos fueron 298 (55,5%) normales, 30 (5,6%) neoplasia intraepitelial cervical de grado 1 (NIC1), 48 (8,9%) NIC2, 111 (20,7%) NIC3, 43 (8,0%) CCE y 7 (1,3%) AIS.

La tabla 1 mostró la correlación entre la detección de ARNm y ADN por tipos de VPH. La concordancia total de las dos pruebas fue del 90,7% (IC 95%: 87,9, 92,9) con un valor kappa de 0,81. Las tasas de positividad del ARNm fueron del 91,7%, 84,6% y 86,4% en las mujeres positivas al VPH16/18, VPH-otros y VPH-total, respectivamente. Todas las tasas positivas de ARNm fueron mayores en las mujeres positivas al VPH que en las negativas al VPH en el mismo grupo de tipo de VPH (todas p < 0,001).

Las tasas positivas de ADN, ARNm y LBC del VPH aumentaron con la gravedad del diagnóstico histopatológico, oscilando entre el 25,5, el 19,1 y el 11,4% en los normales y el 100,0% en los CCE, respectivamente. Las tasas positivas de las tres pruebas en el AIS fueron del 85,7, 85,7 y 100,0%, respectivamente. Estas tres pruebas tuvieron tasas positivas similares en CIN3, SCC y AIS. Sin embargo, las tasas de positividad del ARNm fueron relativamente más bajas en las mujeres con diagnóstico de NIC2. Las tasas de VPH16 positivo fueron las más altas en CIN3, SCC y AIS en comparación con otros grupos de ADN del VPH. Las tasas de positividad del VPH18 fueron inferiores al 7% en todas las lesiones de células escamosas, pero un poco más altas (28,6%) en el AIS (Tabla 2).

La tabla 3 mostró el rendimiento clínico de las tres pruebas en la detección de lesiones CIN2+ y CIN3+. Las sensibilidades del ARNm para detectar CIN2+ y CIN3+ fueron del 93,8% (IC95%: 89,7-96,4) y del 95,7% (IC95%: 91,3-97,9), respectivamente, que no fueron diferentes de las detectadas por el ADN (95,7% para CIN2+, 96,3% para CIN3+), pero superiores a las detectadas por el LBC (80,4% para CIN2+ y 88,8% para CIN3+). Las especificidades del ARNm para detectar CIN2+ (79,0% ) y CIN3+ (70,5% ) fueron significativamente mayores que las detectadas por el ADN (71,0% para CIN2+, 62,8% para CIN3+) (p < 0,05), pero menores que las detectadas por LBC (84,5% para CIN2+, 79,8% para CIN3+). Los VPP del ARNm para detectar NIC2+ y NIC3+ fueron del 74,0% (IC del 95%: 68,4-78,9) y del 58,1% (IC del 95%: 52,1-63,9), y los VPN fueron del 95,2% (IC del 95%: 92,0-97,2) y del 97,4% (IC del 95%: 94,8-98,8), respectivamente.

Las Tablas 4, 5 mostraron las tasas positivas y el rendimiento clínico de las tres pruebas en diferentes grupos de edad. En resumen, todas las pruebas mostraron un mejor rendimiento en las mujeres mayores de 30 años que en las más jóvenes. La prueba del ADN del VPH tuvo la mayor sensibilidad, y el LBC la mayor especificidad para detectar CIN2+ y CIN3+ en mujeres menores de 30 años.

Discusión

Los resultados presentados mostraron que la prueba de ARNm y el ADN tetina alcanzaron una alta concordancia como el 90,7%. Las tasas de positividad del ADN del VPH, del ARNm y del LBC aumentaron con la gravedad del diagnóstico histopatológico, desde el 25,5, el 19,1 y el 11,4% en los normales hasta el 100,0% en los CCE, respectivamente. Las sensibilidades del ARNm para detectar CIN2 y CIN3+ fueron del 93,8% y el 95,7%, que fueron similares a las detectadas por el ADN (95,7% para CIN2+ y 96,3% para CIN3+). Pero las especificidades del ARNm (79,0% para CIN2+ y 70,5% para CIN3+) fueron significativamente mayores que las detectadas por el ADN (71,0% para CIN2+ y 62,8% para CIN3+).

En este estudio, la prueba de ARNm del VPH E6/E7 y la prueba de ADN del VPH mostraron una alta concordancia. De las mujeres que dieron positivo en el ADN del VPH 16/18, el 91,7% también dieron positivo en el ARNm, lo que es similar a otros estudios que informaron de una concordancia general de más del 90% entre la prueba del VPH APTIMA y las pruebas del ADN del VPH (17, 18), y de tasas positivas sistemáticamente más altas para la prueba del ADN del VPH en diferentes poblaciones (19, 20). Observamos tasas positivas más elevadas en las mujeres de mayor edad que en las más jóvenes, lo que difiere ligeramente de otros estudios (21-23). Esta variación puede atribuirse al diseño del estudio (es decir, un estudio hospitalario), que limita la extrapolación de los resultados a la población general. Curiosamente, la tasa de discordancia fue mayor en las mujeres de 30 años o menos (25,6% frente a 8,6%). Los estudios han demostrado una mayor tasa de eliminación espontánea de la infección por VPH en las mujeres más jóvenes, lo que indica una menor posibilidad de integración del VPH (24).

Como sabemos, las pruebas de VPH basadas en el ADN detectan la presencia o la ausencia del ADN del VPH. Sin embargo, la mayoría de las infecciones por VPH son transitorias y desaparecen espontáneamente en el plazo de un año, por lo que no progresarían a precáncer o cáncer cervical (25). La expresión del ARNm del E6/E7 sólo se produce en las células activamente infectadas y aumenta durante el desarrollo y la progresión de la NIC (26). Por lo tanto, se supone que la prueba del ARNm del VPH es más específica para detectar las lesiones cervicales de alto grado. Nuestros datos confirman esta hipótesis. Descubrimos que la prueba de ARNm era tan sensible como la de ADN, pero más específica para detectar el precáncer y el cáncer de cuello uterino. Otros investigadores llegaron a conclusiones similares en el cribado primario (20) o en el triaje de mujeres con citología anormal menor (27). En nuestro estudio, 50 mujeres tuvieron resultados discordantes entre la prueba de ADN del VPH y la de ARNm. Entre ellas, 34 ADN + /ARNm- frente a 8 ARNm + /ARN- fueron diagnosticadas como normales o NIC1; 6 frente a 2 fueron diagnosticadas como NIC2 o NIC3; no se observó ninguna diferencia de prueba en los cánceres. Por lo tanto, si sustituimos la prueba de ADN del VPH por la prueba de ARNm, 34 mujeres no serían remitidas a una colposcopia innecesaria, pero se perderían 4 CIN2 y 2 CIN3. A pesar de la falta de 6 casos, no se perdió la sensibilidad, pero aumentó la especificidad. La literatura mostró que entre el 40 y el 60% de los casos de NIC2 remitirían en un plazo de 2 años (28, 29), y que no todos los casos de NIC3 eran verdaderas lesiones precancerosas (30). Cook et al. también encontraron una baja tasa de CIN2+ entre las mujeres con ARNm/ADN + (17). Por lo tanto, el riesgo de cáncer invasivo para las 6 mujeres era bajo en un intervalo de tiempo corto.

También se evaluó el rendimiento de la prueba en mujeres mayores y más jóvenes. El análisis específico por edad encontró que las tres pruebas funcionaban mejor en las mujeres mayores de 30 años. Basándonos en el hecho de que las mujeres más jóvenes con lesiones CIN tenían una mayor posibilidad de regresión, sugerimos un manejo conservador de las mujeres más jóvenes. Los estudios han encontrado que la infección por VPH era común en las mujeres jóvenes, sin embargo, una gran parte de ellas eran infecciones transitorias, y pueden desaparecer espontáneamente (31, 32). La corta duración de la mayoría de las infecciones por VPH en estas mujeres sugiere que la displasia cervical asociada debe tratarse de forma conservadora (12). Por lo tanto, la prueba de ADN del VPH puede no ser un método de cribado adecuado para las mujeres menores de 30 años, debido a la elevada tasa de falsos positivos. Debe evaluarse el rendimiento del cribado de la citología y del ARNm E6/E7 de forma exhaustiva en mujeres jóvenes. En nuestro estudio, los datos mostraron que la citología tenía la mayor especificidad en las mujeres menores de 30 años, pero la sensibilidad es inferior a la prueba de ADN del VPH. Sin embargo, en el caso del ARNm de E6/E7, tuvo un rendimiento moderado en las mujeres menores de 30 años, que tuvo una mayor sensibilidad que la citología acompañada de una mayor especificidad que el ADN del VPH, lo que sugiere que la prueba de ARNm de E6/E7 puede ser una opción prometedora para el cribado de las mujeres menores de 30 años.

Aunque la Administración de Alimentos y Medicamentos de China aprobó tres vacunas profilácticas contra el VPH (es decir, Cervarix, Gardasil y Cecolin), la prevención del cáncer de cuello uterino sigue dependiendo del cribado. En 2009, el gobierno chino puso en marcha un cribado gratuito del cáncer de cuello de útero en todo el país para las mujeres de las zonas rurales. En 2015, se utilizó por primera vez la prueba de ADN del VPH como herramienta de cribado primario en centros piloto. Sin embargo, debido a su gran población, el cribado basado en el ADN del VPH daría lugar a enormes e inevitables falsos positivos, lo que supondría un desperdicio de recursos sanitarios y una ansiedad innecesaria. Es prometedor que el ARNm pueda utilizarse en el programa nacional de cribado del cáncer de cuello de útero para reducir los falsos positivos sin perder nada de sensibilidad.

Hay que tener en cuenta varias limitaciones en este estudio. En primer lugar, se trata de un estudio transversal y no pudimos evaluar el riesgo de progresión de la lesión asociado al ARNm del VPH E6/E7. Sin embargo, estratificamos nuestros datos por grado histológico, lo que proporciona información sobre la correlación. En segundo lugar, es importante tener en cuenta que los resultados no pueden generalizarse totalmente a la población general porque las participantes en el estudio fueron reclutadas en la consulta externa del hospital.

En conclusión, la prueba de ARNm APTIMA tuvo una buena concordancia con la prueba de ADN del VPH Cobas 4800, con una sensibilidad similar y una mayor especificidad para detectar lesiones cervicales de alto grado. Es prometedor que el ARNm pueda utilizarse en el programa nacional de cribado del cáncer de cuello de útero de China para reducir los falsos positivos sin perder sensibilidad. Se necesitan más estudios para evaluar el rendimiento clínico de la prueba de ARNm en las mujeres más jóvenes de China.

Declaración de disponibilidad de datos

Todos los conjuntos de datos generados para este estudio se incluyen en el artículo/material complementario.

Declaración de ética

Los estudios con participantes humanos fueron revisados y aprobados por el papel de la coexpresión del ARNm del VPH E6/E7 y la proteína p16/Ki-67 en la predicción del riesgo de cáncer cervical. Por el Comité de Revisión Ética de Ciencias de la Vida de la Universidad de Zhengzhou. Los pacientes/participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

Contribuciones de los autores

S-KZ contribuyó al diseño y escribió el manuscrito. ZG contribuyó a la redacción y revisión del manuscrito. PW, M-MJ y P-PG contribuyeron a la investigación y a la prueba de ADN del VPH. L-NK y Z-NW contribuyeron a la prueba de ARNm del VPH. D-MZ contribuyó al examen citológico e histológico. QC y X-QC realizaron el análisis estadístico. X-BS ayudó a concebir el estudio y colaboró en los análisis estadísticos. Y-LQ y J-GZ ayudaron a concebir el estudio y colaboraron en la redacción del manuscrito. J-GZ colaboró en la realización del estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención nº 81502475) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la provincia de Henan (subvención nº 172102310067).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

Agradecimientos

Se agradece la participación de todas las mujeres involucradas en este estudio. También agradecemos la contribución de todos los médicos pertinentes para este estudio y la ayuda del Centro Nacional del Cáncer, el Hospital del Cáncer, la Academia China de Ciencias Médicas y el Colegio Médico de la Unión de Pekín. También agradecimos la 32ª Conferencia Internacional del Papiloma (IPVC 2018) por proporcionar una plataforma para presentar el resumen del estudio (título: Rendimiento clínico de la prueba de ARNm del VPH E6/E7 para detectar la neoplasia intraepitelial de alto grado y el cáncer cervical: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abreviaturas

hr-HPV, virus del papiloma humano de alto riesgo; VIA/VILI, inspección visual con ácido acético/inspección visual con solución de yodo de Lugol; Papanicolaou, papanicolaou; SAHZU, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95%CI, 95% confidential intervals; ECC, endocervical curettage; TCT, prueba citológica ThinPrep; NIC, neoplasia intraepitelial cervical; LSIL, lesión intraepitelial escamosa de bajo grado; HSIL, lesión intraepitelial escamosa de alto grado; LBC, citología de base líquida; VPP, valor predictivo positivo; VPN: valor predictivo negativo; ASC-US: células escamosas atípicas de significado indeterminado; ASC-H: célula escamosa atípica no puede excluir HSIL; AGC: célula glandular atípica; SCC: carcinomas de células escamosas; AIS: adenocarcinoma in situ.