INGENIERÍA DE BIPROCESOS
Evaluación de la diversidad microbiana de bacterias desnitrificantes en reactor discontinuo
S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRACT
Las comunidades microbianas en una planta industrial de lodos activados pueden contribuir al proceso de desnitrificación, pero la información sobre los microorganismos presentes en los reactores desnitrificantes es aún escasa. La eliminación de los compuestos inorgánicos de nitrógeno puede lograrse mediante la adición de fuentes de carbono al proceso biológico de desnitrificación. El etanol es una alternativa económicamente viable como fuente de carbono en países tropicales como Brasil, con una producción a gran escala a partir de la caña de azúcar. Este trabajo reporta la aplicación exitosa de lodos activados con nitrato y etanol en un reactor anaeróbico discontinuo. La operación duró 61,5 h con consumo total de nitrato en 42,5 h, generación de nitrito (2,0 mg/L) y consumo de etanol (830,0 mg/L) en 23,5 h. Los recuentos de células desnitrificantes por el número más probable al inicio de la operación fueron menores que al final, confirmando la capacidad del inóculo de lodos activados para el proceso de desnitrificación. Las muestras de los recuentos celulares se identificaron como Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. y bacterias no cultivadas. Por tanto, estas especies pueden estar implicadas en la reducción de nitratos y el consumo de etanol en el reactor discontinuo.
Palabras clave: Sistema de lodos activados; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrato; Etanol.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos capaces de desnitrificar están ampliamente distribuidos en la naturaleza: suelo, sedimento, agua dulce, mar y sistemas de tratamiento de aguas residuales (Park & Yoo, 2009).
Muchos inóculos de plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales pueden contener bacterias desnitrificantes, principalmente en sistemas de lodos activados (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), donde la eliminación biológica de nitrógeno se produce para promover la desnitrificación, es decir, en condiciones anóxicas heterótrofas, las fuentes de carbono orgánico actúan como donantes de electrones y reducen el nitrato a gas nitrógeno (Canto et al., 2008). La presencia de fuentes de carbono orgánico y energía es necesaria para la desnitrificación heterótrofa (Nava et al., 2010).
La mayoría de las bacterias desnitrificantes se engloban en el Phylum Proteobacteria, incluyendo Acidovorax, Comamonas y Acinetobacter, entre otras. Estas bacterias pueden estar presentes en el tratamiento de residuos, especialmente en los sistemas de lodos activados, que son capaces de formar nitrógeno molecular a partir de nitrato y una fuente de carbono exógena, como el etanol. La desnitrificación completa, es decir, de nitrato a nitrógeno gaseoso, está mediada por especies bacterianas que normalmente utilizan el oxígeno del aire como fuente de energía (respiración aeróbica), pero también tienen la capacidad de utilizar nitrato y nitrito en lugar de oxígeno (condición anóxica). Así, estas bacterias pueden crecer de forma aeróbica en ausencia de nitrato, o en condiciones anóxicas en presencia de nitrato. La conversión de nitrato en nitrógeno molecular también se conoce como respiración anóxica (Park & Yoo, 2009).
Se ha utilizado una amplia variedad de compuestos orgánicos, como metanol, etanol, glucosa, acetato, aspartato o ácido fórmico y compuestos aromáticos (Queiroz et al., 2011). Sin embargo, la mayoría de las investigaciones publicadas en relación con la desnitrificación del agua potable implican el uso de metanol, etanol y ácido acético (Park & Yoo, 2009). El etanol (Daniel et al., 2009), la glucosa y el acetato son algunos de los donantes externos de electrones utilizados con éxito para la desnitrificación. Particularmente en Brasil, el etanol representa una alternativa viable (Gavazza dos Santos et al., 2004). El etanol se produce a gran escala en Brasil desde 1975, con el Programa Nacional de Alcohol (19751985). Brasil produce cerca de 2,6 x 108 toneladas de caña de azúcar, que son procesadas por 324 ingenios para producir azúcar y etanol (Borrero et al., 2003). Se produce abundantemente a partir de la caña de azúcar y suele costar menos que otras fuentes de carbono convenientes. Sin embargo, la necesidad de fuentes adicionales de donantes de electrones para el proceso exógeno aumenta los costos operativos, lo que posiblemente representa un inconveniente para el uso de tecnologías innovadoras basadas en procesos anaeróbicos (Gavazza dos Santos et al., 2004).
Las relaciones estequiométricas que describen la reacción energética bacteriana (Park & Yoo, 2009) se escriben de la siguiente manera, cuando se utiliza etanol como fuente de carbono:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Aunque esta ecuación revela la cantidad estequiométrica de etanol requerida para la disimilación de los nitratos, se necesita etanol adicional para la desoxigenación y la síntesis celular. En la práctica, entre el 25% y el 30% del etanol necesario se utiliza para la síntesis de células bacterianas. Cuando hay oxígeno disuelto, la necesidad de etanol es correspondientemente mayor. Por lo tanto, un valor de trabajo común de la relación de peso de sustrato a nitrato (C:N03) es casi 3 (Park & Yoo, 2009).
Sólo hay unas pocas referencias sobre reactores discontinuos y el proceso de desnitrificación. Estas configuraciones pueden utilizarse para investigar los requisitos nutricionales (Maintinguer et al., 2008). El proceso de desnitrificación con carbohidratos complejos se está evaluando en reactores discontinuos porque la materia orgánica particulada que está presente en estos sistemas puede dificultar el funcionamiento en otras configuraciones, como por ejemplo con almidón (Iamamoto, 2006). Además, la biomasa queda retenida en el reactor discontinuo en todos los periodos de operación en comparación con los reactores de flujo continuo. Estos hechos pueden contribuir al consumo total de nitrato verificado en el reactor discontinuo (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
La eliminación de nitrato con inóculo de lodos activados ha sido estudiada particularmente en países de clima templado. Hay pocos informes de estudios sobre la eliminación de nitrato y la biología molecular con inóculo de lodos activados de los países tropicales como Brasil. En este sentido, el primer objetivo de nuestro estudio fue evaluar el proceso de desnitrificación con lodos activados como inóculo de climas tropicales. El segundo objetivo de nuestro estudio fue realizar una caracterización microbiana del inóculo con el fin de identificar los posibles organismos específicamente involucrados en el proceso de desnitrificación.
Este trabajo estudió la diversidad microbiana de la desnitrificación en un reactor discontinuo alimentado con etanol y nitrato utilizando técnicas de biología molecular y metodología tradicional de microbiología.
MATERIAL Y MÉTODOS
Reactor discontinuo
El experimento se realizó con lodos del sistema de lodos activados de la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales de Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasil).
Los reactores discontinuos fueron preparados por triplicado en matraces Duran® de 2 L, donde 1 L fue el medio de reacción, 10% (v/v) de inóculo (100 mL/L).
Los reactores fueron sometidos a una atmósfera de N2 (99,99%) durante 20 min después de la distribución de las soluciones. Después, se taparon con tapones de goma butílica, se envolvieron y se mantuvieron a 25 ºC ± 1 ºC, con agitación a 120 rpm operada durante 61,5 h.
Análisis físico-químicos y cromatográficos
Los sólidos volátiles totales (STV) y el consumo de nitratos se determinaron según APHA, 2005, espectrofotométricamente. El análisis de nitritos se realizó por inyección de flujo (FIA APHA, 2005). Los ácidos grasos volátiles y los alcoholes se determinaron por cromatografía de gases en un GC-2010 de Shimadzu, equipado con un detector de ionización de llama, automuestreador para espacio de cabeza COMBI-PAL – AOC modelo 5000 y columna HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm de espesor de película), según Maintinguer et al, 2008).
Cuantificación de bacterias desnitrificantes
El número más probable (NMP) de bacterias desnitrificantes se realizó a cinco veces la dilución al principio y al final de la operación del reactor discontinuo, según Tiedje (1982), adaptado para muestras líquidas. Los recuentos de células por el método del NMP se realizaron tras 15 días de incubación, según APHA, 2005. La composición del medio de cultivo y, las concentraciones de nitrato y etanol utilizadas en los ensayos de NMP fueron similares a las del funcionamiento del reactor discontinuo, como se ha mencionado anteriormente.
Biología molecular
Las muestras para el análisis del ARNr 16S se obtuvieron a partir de los recuentos por dilución positiva más altos (NMP) de bacterias desnitrificantes al final del ensayo de los reactores discontinuos.
El ADN genómico total de las muestras se adquirió después de la lisis de las células con perlas de vidrio (Sigma) y la extracción con fenol-cloroformo como se describió previamente por Griffiths et al. (2000) modificado.
La amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó con un conjunto de cebadores de dominio bacteriano para el gen 16S rRNA, 27 hacia adelante (5′-AGAGTT TGATCCTGCTCAG-3′) y 1100 hacia atrás (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). La amplificación por PCR (termociclador Eppendorf AG – Hamburgo 22.331) se realizó con desnaturalización inicial a 94 ºC durante 5 min, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 45 s, recocido a 55 ºC durante 45 s, extensión a 72 ºC durante 1,45 min y extensión final a 72 ºC durante 7 min y enfriamiento a 4 ºC.
Las muestras de los productos de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (ARNr 16S) se clonaron en el vector plasmídico pGEM (Promega Easy Vector System I) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los clones se seleccionaron al azar y se amplificaron por PCR. La secuenciación de los nucleótidos se realizó en un secuenciador automatizado ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando un cebador M13 forward (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). La amplificación por PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) se realizó con desnaturalización inicial a 94 ºC durante 2 min, seguida de 25 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, recocido a 55 ºC durante 1 min, extensión a 72 ºC durante 1 min; y extensión final a 72 ºC durante 7 min y enfriamiento a 4 ºC.
Las secuencias de nucleótidos se procesaron y se alinearon con el programa Seqman (paquete Lasergene DNAstar) para eliminar las señales del vector y las bases de baja calidad. Las secuencias alineadas se determinaron mediante el programa de búsqueda BLAST en el sitio web del NCBI y se compararon con las secuencias de organismos del gen 16S rRNA representadas en la base de datos Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). El árbol filogenético se construyó por el método Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) utilizando el programa MEGA versión 4.1 (Kumar et al., 2008). Se realizó un análisis de remuestreo Bootstrap para 1000 réplicas para estimar la confianza de las topologías de los árboles. Se añadieron las secuencias conocidas de Aspergillus niger (FJ828924.1) y se utilizó como grupo externo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El nitrato se consumió completamente tras 42,5 h de funcionamiento (Figura 1). La generación de nitritos se redujo (2,0 mg/L a las 18,5 h) y se produjo a las 23,5 horas de funcionamiento. Se observó 1,06 g de etanol/L (36% de consumo) tras 13,5 h de funcionamiento para una concentración inicial de 1.650 mg/L. El consumo de etanol al final del experimento fue del 54% (0,77 g/L en 61,5 h). Estos resultados fueron casi los de Gusmão et al. (2006). Los autores (op.cit.) observaron un 98,9% de consumo de nitrato en 14 h de operación, con células purificadas de lodo granular de un manto de lodo anaeróbico de flujo ascendente (UASB) que trataba aguas residuales de un matadero de aves (DAKAR-Tietê SP Brasil), con nitrato (350 N-NO3 mg/L), etanol (377 mg/L) y benceno (10 mg/L) como fuentes de carbono.
El metanol (197,78 mg/L) y el n-butanol (23,50 mg/L) fueron detectados al inicio del experimento. Estos alcoholes (metanol y n-butanol) estaban posiblemente presentes en el inóculo. La concentración de los alcoholes mostró poca variación hasta el final del ensayo, lo que indica que no fueron consumidos bajo esta condición desnitrificante (Figura 2).
La máxima generación de ácido acético fue de 16,7 mg/L a las 61,5 h de funcionamiento. Los valores de VCP al inicio y al final de la operación del reactor discontinuo fueron de 5,14 g/L y 11,40 g/L, respectivamente, lo que indica un aumento del 122% de la biomasa. Estos resultados mostraron que las condiciones de operación impuestas en el reactor batch beneficiaron el desarrollo y la permanencia del consorcio bacteriano en condiciones de desnitrificación.
En este estudio se observó el proceso de desnitrificación, como también fue descrito por otros autores utilizando diferentes configuraciones para los reactores.
Callado &Foresti (2001) operó reactores anaerobios alimentados con sustrato sintético simulando aguas residuales domésticas para eliminar la mayor fracción de materia carbónica y promover la nitrificación del sustrato, la desnitrificación y la eliminación biológica de fosfatos en el mismo ciclo discontinuo, en un reactor discontinuo secuencial anaerobio/aerobio/anaerobio. El sistema fue operado durante 41 días con 84 ciclos de 12 horas, a la temperatura de 28±1 ºC. Los autores (op.cit,) observaron que la desnitrificación ocurría bajo condiciones alternas aeróbicas y anóxicas en la fase de reacción. Ambos procesos ocurrieron sólo cuando se agregó acetato de sodio (500 mg/L) al comienzo de la fase anóxica.
Etchebehere et al. (2001), probaron el acetato (40 mmol/L) y la glucosa (13 mmol/L) como fuentes de carbono para la desnitrificación en un reactor anaeróbico discontinuo con nitrato de potasio (20mmol/L) para tres inóculos diferentes: lodos de un reactor anóxico (a escala de laboratorio) para eliminar el carbono y el nitrógeno del lixiviado de un vertedero sanitario; lodos de un reactor metanogénico UASB para el tratamiento de la malta y lodos de un reactor anóxico alimentado con acetato y nitrato. El nitrato se consumió por completo en las tres muestras de lodos ensayadas, como se observó en el presente estudio. Los autores (op. cit.) concluyeron que el acetato es una mejor fuente de carbono que la glucosa.
Gavazza dos Santos et al. (2004) estudiaron el proceso de desnitrificación llevado a cabo en reactores discontinuos alimentados con aguas residuales sintéticas que simulaban los efluentes nitrificados de las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas utilizando tres fuentes donantes de electrones: metanol (53,3 mg/L), etanol (38,3 mg/L) y metano (además del agua residual sintética). Los autores (op.cit.) observaron que el donante de electrones más eficaz era el etanol, que eliminaba por completo el nitrito y el nitrato, como se observó en este trabajo.
Iamamoto (2006) obtuvo una eliminación de nitrógeno superior al 84% en un reactor discontinuo secuencial alimentado con almidón y amonio alternando condiciones anóxicas y aeróbicas (ciclos de 2h/2h) y 2 mg O2/L para las siguientes concentraciones: 125 mg N-NH4/L y 0,95 g de almidón/L, 250 mg N-NH4/L y 1,9 g de almidón/L, 500 mg N-NH4/L y 3.8 g de almidón/L, con inóculo procedente de un sistema de lodos activados de una Estación de Tratamiento de Aguas Residuales (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasil). También se probó el etanol (1.500 mg/L) como fuente de carbono junto con 500 mg de NH4-N/L. Los autores (op.cit.) observaron que la remoción de nitritos y nitratos fue completa (100%), tal como se observó en el presente estudio, demostrando la viabilidad del uso de etanol en el proceso de desnitrificación.
Los recuentos de células desnitrificantes por NMP al inicio de la operación del reactor batch fueron menores (1,1 x 1010 NMP/mL) que al final de la operación (1,2 x 1019 NMP/mL) (Figura 3). Estos resultados son más altos que los reportados en la literatura, descritos a continuación.
Etchebehere et al. (2001) enumeraron células desnitrificantes por el número más probable (NMP) en un medio basal suplementado con extracto de levadura (0,5 g/L), acetato de potasio (1,84 g/ L) y nitrato de potasio (0,72 g/ L) y obtuvieron 9,6 x 106 NMP/mL con lodos del reactor anóxico de un sistema de tratamiento de lixiviados. Callado y Foresti (2001) utilizaron acetato de sodio como fuente de carbono en un reactor discontinuo secuencial anaeróbico/ aeróbico/anaeróbico y encontraron más bacterias desnitrificantes MPN al principio de la operación (2,5 x 106 MPN/mL) que al final (3,5 x 105 MPN/mL). Los autores (op.cit.) concluyeron que esta disminución no afectó al proceso de desnitrificación.
Iamamoto (2006) obtuvo el mismo orden de magnitud en el NMP de bacterias desnitrificantes al final de la operación de un reactor discontinuo secuencial con 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 NMP/mL) y 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), ambos con adición de almidón (1.900 mg/L) como fuente de carbono e inóculo de lodo activado de una planta de tratamiento de aguas residuales (Rio Claro SP – Brasil).
Las bacterias desnitrificantes fueron favorecidas por la condición nutricional impuesta en el reactor anóxico. Este hecho confirmó la capacidad del inóculo de lodos activados para el proceso de desnitrificación.
De la muestra analizada se obtuvieron 50 clones para la clonación y secuenciación de los fragmentos del gen 16S rRNA del consorcio microbiano. Sin embargo, los clones con valores inferiores a 180 nucleótidos no se incorporaron al análisis filogenético porque no eran suficientes para ser comparados con la base de datos descrita a continuación. Las secuencias de clonación y secuenciación se obtuvieron a partir de la muestra positiva a la dilución más alta del NMP (10-18) (Tabla 1).
Acinetobacter sp. se identificó con las similitudes de: 98% (clones 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 y 2, 4, 18, 20, 23 y 27) y 99% (clones 6, 15, 16, 37 y 38). Es una bacteria Gram-negativa, no móvil, oxidasa-negativa, no fermentativa, en parejas y pertenece al Phylum Proteobacteria, Familia Moraxellaceae. Es un microorganismo importante en el suelo, donde puede contribuir a la mineralización, por ejemplo, de los compuestos aromáticos (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) aislaron cepas de Acinetobacter en una muestra de un sistema de lodos activados (Jizhuangzi Tianjin – China). Esta cepa fue capaz de biodegradar fenol (1,1 g/L) mediante células libres e inmovilizadas. Geng et al. (2006) aislaron bacterias degradadoras de fenol en una muestra de un sistema de tratamiento de lodos activados (Singapur). Las pruebas bioquímicas mostraron que estos microorganismos pueden crecer en presencia de etanol, glucosa, sacarosa y compuestos aromáticos como tolueno, fenol y benzoato. Se describió como una nueva especie, Acinetobacter EDP3. Los autores (op.cit.) concluyeron que esta especie puede utilizarse para eliminar compuestos fenólicos o para la biorremediación in situ del fenol en los suelos. Cai et al. (2009) identificaron 58 bacterias resistentes procedentes de suelos contaminados por arsénico. Las cepas Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas y Stenotrophomonas fueron identificadas en altas concentraciones (20 mM Ar/L). Acinetobacter sp. identificado en este trabajo tuvo su crecimiento debido a las condiciones operativas impuestas y podría contribuir a la desnitrificación.
Los clones 24 y 26 fueron similares a Comamonas sp. con similitudes del 98% y 97%, respectivamente. Las Comamonas son bacterias Gram negativas que pertenecen al filo Proteobacteria y a la familia Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) aislaron bacterias desnitrificantes Gram-negativas de un reactor anóxico utilizado para el tratamiento de lixiviados de vertedero en Montevideo (Uruguay). La especie aislada tenía similitud con Comamonas terrigena. Sin embargo, este microorganismo fue considerado una nueva especie, denominada Comamonas nitrativorans. Se describió como una bacteria gramnegativa, de flagelo polar móvil, aeróbica y quimioorganotrófica. Esta especie creció en etanol, acetato y butirato, nitrato, nitrito y puede reducir el nitrato a N2.
Por lo tanto, las especies de Comamonas identificadas en este estudio estaban presentes en el inóculo de lodos activados y podrían contribuir a la desnitrificación que se produjo en las pruebas.
Los clones 25, 28, 34, 36, 42 y 65 fueron similares a Acidovorax sp. con similitudes del 99% y 97%, respectivamente (Tabla 1). Acidovorax sp. pertenece al filo de las proteobacterias; se encuentra fácilmente en los sistemas de lodos activados. Muchas especies de Acidovorax actúan como microorganismos reguladores de los procesos de tratamiento microbiológico en los sistemas de lodos activados. Varias especies de Acidovorax se utilizan en la biodegradación de plásticos y en la eliminación de otros contaminantes orgánicos, incluyendo nitrofenoles, nitrobenceno y bifenilos policlorados a través de la desnitrificación (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) aislaron especies de bacterias desnitrificantes que degradan el PHBV (poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) de tres sistemas de lodos activados, utilizados para tratar las aguas residuales municipales (Nagoya, Osaka y Toyohashi – Japón). Los 37 clones analizados mostraron similitud con organismos pertenecientes a la clase Betaproteobacteria. La mayoría de los clones mostraron similitud con la especie Acidovorax, confirmando que esta especie estaba implicada en la degradación del PHBV en condiciones de desnitrificación. Gentile et al. (2007) aislaron especies similares a Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium y Achromobacter de un reactor desnitrificante operado con etanol (40,0 g/L) y ácido láctico (40,0 g/L) como fuentes de carbono; probaron donantes de electrones por separado y se utilizó nitrato (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) como fuente de nitrógeno. Los autores (op. cit.) concluyeron que la reducción completa del nitrato a N2 fue realizada por las especies de Acidovorax, mientras que Achromobacter sp. y Delftia acidovorans fueron responsables de la desnitrificación incompleta del nitrato a nitrito. Por lo tanto, las especies de Acidovorax estaban presentes en las muestras analizadas en este estudio y podrían estar implicadas en la desnitrificación que se produjo en el reactor discontinuo.
Se identificaron cepas bacterianas cultivadas de la familia Rhodocyclaceae con un 98% de similitud (clon 9 – AY945917.1 y clones 46, 84 AY945905), como se muestra en la Tabla 1. Los miembros de la familia Rhodocyclaceae son bacterias Gram negativas que pertenecen a la clase Betaproteobacteria. Son bacilos aeróbicos desnitrificantes con una capacidad metabólica versátil. La mayoría de las especies viven en hábitats acuáticos y en condiciones de suelo oligotrófico. Muchas de ellas están presentes en las aguas residuales y desempeñan un papel importante en el tratamiento de descontaminación biológica de estos lugares (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006), alimentaron un reactor desnitrificador con quinolina (40 mg/L) una amina tóxica utilizada en la fabricación de tintes, pesticidas y combustibles sintéticos, glucosa (180 mg/L), nitrato y fosfato de potasio (C/N/P de 150:30:1). El inóculo procedía del segundo tanque de sedimentación del sistema de tratamiento de aguas residuales de la industria Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japón). La eliminación de la quinoleína fue del 90,2% tras el período de estado estacionario del reactor (6 semanas). Los análisis biológicos moleculares del inóculo y del reactor desnitrificador revelaron la presencia de bacterias no cultivadas, Thauera y Azoarcus en ambas pruebas. Según los autores, los porcentajes de clones afiliados a bacterias pertenecientes a Azoarcus y Thauera fueron del 74% en el reactor desnitrificador y del 4% en el inóculo, respectivamente. El conocimiento de los microorganismos de las muestras ambientales depende de las condiciones de laboratorio con cultivos puros (Pace, 1997). Sin embargo, se conoce menos del 1% de las bacterias de diferentes ecosistemas (Amann, 1995), o sea que aproximadamente el 99% no han sido estudiadas e identificadas. Por lo tanto, en este trabajo esperábamos obtener secuencias similares de bacterias no cultivadas.
El árbol filogenético obtenido con los cebadores de dominio Bacteria de consenso en los análisis de biología molecular del experimento se ilustra en la Figura 4.
Los coeficientes de similitud entre los diferentes grupos de microorganismos eran del 97% al 99% e indicaban la presencia de especies filogenéticamente relacionadas, basándose en las secuencias de evaluación parcial del gen 16S rRNA. Las secuencias conocidas de las especies procedían de la base de datos del NCBI con Aspergillus niger (FJ828924.1) como secuencia de grupo externo.
Por lo tanto, las especies de Acidovorax, Comamonas y Acinetobacter identificadas en este estudio estaban presentes en el sistema de lodos activados de Volkswagen São Carlos Motors y podrían estar implicadas en la reducción de nitratos y el consumo de etanol.
CONCLUSIONES
Se ha demostrado el potencial del inóculo de un sistema de lodos activados y el uso de etanol como fuente de carbono en un proceso de desnitrificación en un reactor discontinuo.
Los valores de bacterias desnitrificantes del NMP obtenidos en este estudio, combinados con los resultados de la eliminación de nitrato, revelaron que existían bacterias desnitrificantes en el inóculo procedente de un sistema de fangos activados, que se vieron favorecidas por las condiciones nutricionales impuestas.
Los clones identificados tenían una filiación filogenética en el phylum Proteobacteria, clase Alphaproteobacteria y Gamaproteobacteria, con Acidovorax sp, Acinetobacter sp., Comamonas sp. y bacterias no cultivadas. Estas bacterias podrían estar implicadas en la reducción de nitratos y en el consumo de etanol en el reactor anóxico discontinuo.
Agradecimientos
Los autores agradecen las subvenciones recibidas de FAPESP y CNPq.
APHA, AWWA y WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22ª edición, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. Tesis de doctorado, Universidad de São Paulo, Brasil, Escuela de Ingeniería, Universidad de São Carlos, Brasil (2006).
Messing, J., New M13 vectors for cloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).