Ensayo de placas

El ensayo de placas puede utilizarse para purificar una población clonal de virus o para determinar el título viral como unidades formadoras de placas por ml (ufp/ml), de modo que puedan utilizarse cantidades conocidas de virus para infectar células durante el trabajo posterior. En este ensayo, las monocapas celulares se infectan con una proporción baja de virus, de manera que las células esporádicas se infectan. Una capa de agarosa mantiene las células estables y limita la propagación del virus. Cuando cada célula infectada produce el virus y acaba lisándose, sólo se infectan las células inmediatamente adyacentes. Cada grupo de células infectadas se denomina placa. Las células no infectadas rodean las placas. Tras varios ciclos de infección, las células infectadas en el centro de las placas comienzan a lisarse y las células infectadas periféricas permanecen rodeadas de células no infectadas. Este fenómeno hace que la luz que pasa a través de las células infectadas se refracte de forma diferente a la de las células circundantes no infectadas, y la placa puede visualizarse a simple vista o mediante microscopía de luz. Cada placa representa un solo virus. Por lo tanto, las poblaciones clonales de virus pueden purificarse aislando placas individuales. Las placas individuales obtenidas a partir de distintas diluciones de un stock viral pueden contarse para determinar el título viral (ufp/ml) de un determinado stock de transfección o de virus. El estado de las células y su distribución uniforme sobre la superficie de la placa de cultivo de tejidos es importante para el éxito de un ensayo de placas. Las células deben estar sanas, > 95% viables y en fase logarítmica de crecimiento en el momento del ensayo. Las células grumosas, las células que no están distribuidas uniformemente con la densidad correcta (>70%) en la placa y las células que no se adhieren a las placas de cultivo de tejidos en los 30 minutos siguientes a la colocación son perjudiciales para el ensayo.

Materiales adicionales necesarios:

Agarosa para el ensayo de placa, Cat. Nº 554766
Medio celular para insectos no suplementado de Grace
Suero bovino fetal
Plato de cultivo de tejidos, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
Baño de agua a 42°C

Protocolo

Determinar el número de placas necesarias

Para cada cotransfección o stock de virus (y control positivo) hacer duplicados de diluciones en serie (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Etiquete cada placa de 60 mm con las descripciones de la muestra y la dilución.

Siembre la placa de cultivo con células de insecto

1. Siembre 2,3 x 10 6 células Sf9 en cada placa de 60 mm. Mueva suavemente las placas de un lado a otro y luego de un lado a otro para distribuir uniformemente las células en la superficie de la placa. No agitar nunca la placa, ya que esto provoca una distribución desigual de las células. Una vez sembradas las placas, deje que las células se adhieran durante 30 minutos a una hora. Durante este tiempo, prepare la solución de agar y las diluciones virales. Visualice, mediante microscopía de luz, para confirmar la confluencia del >70% y la distribución uniforme de las células.

Prepare la solución de agarosa

Las células sembradas se superponen con una solución de agarosa al 1% en el Medio Celular para Insectos de Grace suplementado con FBS al 10%.

1. Primero, equilibre el baño de agua a 42°C. Determine el volumen total de solución de agar necesario: multiplique 4 ml/placa por el número de ensayos de placa. De este volumen total, una mitad será dH 2 O autoclavado + agarosa para hacer una solución al 2%, y la otra mitad será medio para insectos de Grace suplementado con 10% de FBS. Para determinar la cantidad, en gramos, de agarosa de ensayo de placas necesaria para hacer una solución final de agarosa al 1%, multiplique el volumen total por 0,01. (Por ejemplo, 10 placas x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Añadir la cantidad adecuada de dH 2 O esterilizado en autoclave en un frasco de vidrio estéril de tamaño adecuado. A continuación, añadir LENTAMENTE la cantidad calculada de agarosa, mientras se agita suavemente para mezclar el dH 2 O y la agarosa. Caliente la mezcla en el microondas hasta que esté en ebullición. Retire el frasco e inspeccione la mezcla para ver si hay agarosa sin disolver. Si hay alguna, seguir calentando. Repetir la operación hasta que la agarosa se haya disuelto completamente (ATENCIÓN: la mezcla y el vapor que la acompaña están muy calientes y pueden quemar. Utilice el equipo de seguridad y las precauciones adecuadas). Una vez que la agarosa se haya disuelto completamente, tapar el frasco sin apretarlo y transferirlo al baño de agua a 42°C. Deje que la mezcla se enfríe a 42°C.
3. Obtenga Grace’s Insect Media y añada suero bovino fetal al 10%. Ejemplo: para 100 ml de Grace’s Insect Media, añadir 10 ml de FBS. Coloque la mezcla de medio de Grace + 10% de FBS en el baño de agua a 42°C.

Prepare las diluciones virales en serie

1. Para cada cotransfección, etiquete seis tubos estériles de 15 ml de 10 -1 a 10 -6 con la descripción de la muestra apropiada. Añada 2,7 ml de medio TNM-FH a cada tubo. Añada 0,3 ml del sobrenadante de la cotransfección al primer tubo y agite en vórtex. Realice diluciones en serie transfiriendo 0,3 ml a la siguiente dilución, utilizando una pipeta nueva cada vez.

Infecte las células en monocapa

1. En este punto, las células han tenido tiempo suficiente para adherirse a la superficie de la placa. Compruebe varias placas bajo un microscopio de luz para confirmar la confluencia del 70% y la distribución uniforme de las células.
2. Trabajando con las placas duplicadas de cada dilución, aspire cuidadosamente los medios de las células utilizando una punta de pipeta estéril de 200 µl y el vacío. No desbaratar la lámina celular. Añadir 1 ml de la dilución vírica correspondiente a cada una de las placas duplicadas y agitar suavemente la placa hacia delante y hacia atrás, y luego de lado a lado para distribuir uniformemente el virus. Repetir con todas las placas y diluciones correspondientes.
3. Mecer suavemente las placas a temperatura ambiente, en campana estéril cada 15 minutos durante 1 hora.

Superponer las células infectadas con agarosa

1. Después de 1 hora, confirmar que la solución de agarosa está a 42°C. La solución debe estar lo suficientemente caliente para que aún esté en estado líquido, pero debe estar lo suficientemente fría para poder sostenerla con la mano. Si no se puede sostener cómodamente el frasco, la solución está demasiado caliente y matará las células Sf9. Confirme que el medio para insectos de Grace con 10% de FBS está a 42°C. Si es así, añada un volumen igual a la solución de agarosa para completar la solución final de agar. Mezcle bien la solución final de agar.
2. Una vez que la solución esté lista, colóquela en un vaso de precipitados de vidrio lleno de agua del baño de agua. Esto debería evitar que la solución se solidifique mientras la usas bajo la campana. Durante el procedimiento, compruebe periódicamente la temperatura del agua en el vaso de precipitados. Si empieza a enfriarse, sustitúyala por agua caliente del baño de agua.
3. Trabajando con un par de duplicados a la vez, aspire cuidadosamente los medios de las células utilizando una punta de pipeta estéril de 200 µl y aspire. No desbaratar la lámina celular. Mientras aspira, incline ligeramente la placa y aspire el sobrenadante del borde de la placa. Esto permitirá una aspiración óptima sin perturbar la lámina celular. Después, añada lentamente 4 ml de solución de agar a cada placa y deje que el agar se solidifique.
4. Una vez que el agar de todas las placas se haya solidificado, coloque cuidadosamente las placas en una cámara de incubación limpia y hermética. Humedezca la cámara colocando una gasa estéril y 10 ml de agua estéril en un plato de cultivo de 10 mm en la rejilla inferior de la cámara de incubación. Sellar la cámara y colocarla en una incubadora a 27°C. Deje que las placas se incuben durante 6 – 10 días.
5. Las placas pueden visualizarse invirtiendo las placas sobre un fondo oscuro e iluminándolas con una fuente de luz fuerte desde el lado de la placa, o sosteniéndolas en un ángulo de 45° hacia una fuente de luz. Cuando aprenda a identificar una placa, marque las posibles placas con un rotulador. Utilizando el microscopio de luz, visualice a baja potencia para confirmar que hay un área de limpieza en el césped de células. Visualice a alta potencia para buscar células infectadas en la periferia del claro, y luego menos células infectadas a medida que se aleja del área de claro.
6. Para facilitar la visualización de las placas, superponga con 3 ml de agarosa al 0,5% (preparada como se describió anteriormente) que contenga 50 µg/ml de rojo neutro. (Prepare una solución madre de rojo neutro (Sigma N7005) a 1 mg/ml en agua o PBS. Filtrar-esterilizar y almacenar a 4°C en la oscuridad). Dejar endurecer e incubar la placa durante la noche a 27°C. El rojo neutro teñirá las células sanas y las placas aparecerán como áreas claras, de aproximadamente 0,5 a 3 mm de diámetro sobre un fondo blanco. Dado que el rojo neutro es un colorante vital, es importante teñir mientras la monocapa celular está sana, es decir, de 4 a 7 días después de la infección.

Purificación de las placas a partir del stock viral

Para asegurar un aislamiento adecuado, es mejor que las placas se recojan de placas que contengan menos de 50 placas. Plantee varias diluciones del virus para asegurarse de que se obtiene un número suficientemente bajo de placas. Las placas pueden recogerse utilizando puntas de micropipeta estériles (1.000 µl) o tubos microcapilares.

Amplificar el virus a partir de la recogida de placas

1. Marcar la placa bajo la placa con un marcador. Con una punta de pipeta estéril, retire un tapón de agarosa directamente sobre la placa. Recoja entre 10 y 100 placas de esta manera.
2. Coloque cada tapón de agarosa en un tubo de microcentrífuga separado que contenga 1 ml de medio de cultivo de tejidos. Eluir las partículas de virus de la agarosa rotando el tubo durante toda la noche a 4°C.
3. Añadir 200 µl de cada recogida de placas a pocillos separados de una placa de cultivo tisular de 12 pocillos sembrada con 2 x 10 5 células por pocillo en 1 ml de medio TNM-FH fresco. Incubar las placas durante 3 días a 27°C.
4. El sobrenadante del virus de este caldo de paso puede recogerse y centrifugarse durante 5 min a 1.000 x g a 4°C para eliminar los restos. Almacenar a 4°C.
5. Sembrar una placa de cultivo de tejidos de 100 mm con 5 x 10 6 células por cada placa aislada. Dejar que las células se adhieran y sustituir el medio por 10 ml de medio TNM-FH fresco.
6. Añadir 200 µl del caldo de paso-uno a la placa de 100 mm e incubar a 27°C durante 4 días. Guarde los 800 µl restantes del caldo de paso uno a 4°C como reserva.
7. Recoja el sobrenadante viral y centrifugue para eliminar los restos. Determine el título de este caldo del segundo paso. Si el título sigue siendo inferior a 2 x 10 8 ufp/ml, pase a la amplificación de baculovirus.