Efectos diferenciales sobre la permeabilidad de la membrana y la viabilidad de las células de queratinocitos humanos sometidas a campos megasónicos de muy baja intensidad

Se estudió el efecto de la exposición a US de muy baja intensidad (Ispta entre 7 y 16 mW/cm2, muy por debajo del umbral de cavitación, 100 mW/cm2) con una frecuencia de 1 MHz en células HaCaT. Los experimentos se llevaron a cabo con un montaje médico equivalente, como se muestra en la Figura S1 de ESI, variando los parámetros de tratamiento, como la Ispta, el ciclo de trabajo y el tiempo de sonicación. Los experimentos preliminares señalaron que, en el rango de parámetros de exposición involucrados aquí, la temperatura se mantuvo constante (dentro de 1 °C) excluyendo la disipación térmica de la energía de los Estados Unidos. Además, los tratamientos no mostraron ninguna dependencia significativa de los efectos estudiados con respecto al ciclo de trabajo de la onda US. Estas observaciones son consistentes con la baja absorción de US a 1 MHz; por el contrario, los efectos térmicos y el ciclo de trabajo podrían afectar a las células y tejidos expuestos a frecuencias más altas, siendo el coeficiente de atenuación de US proporcional a la frecuencia23,31.

Los resultados se presentarán inicialmente considerando los dos parámetros de exposición relevantes, tiempo de sonicación e Ispta, por separado. Se analizarán las alteraciones estructurales y físicas de la membrana celular (permeabilidad, eficiencia de captación y tamaño máximo de las moléculas internalizadas) y se correlacionarán con el correspondiente daño citotóxico y con la posible activación de patrones inflamatorios. Posteriormente, los resultados se interpretarán en función de la dosis de sonicación, definida como el producto de la Ispta por el tiempo de exposición, es decir, la densidad superficial de la energía acústica que incide en la muestra durante la sonicación. En realidad, los fenómenos estudiados dependen de esta cantidad y esto nos permitió identificar un rango de parámetros de exposición en el que se produce una SP transitoria con daños biológicos insignificantes.

Análisis de la influencia del tiempo de exposición a US

Las alteraciones en la permeabilidad de la membrana de las células HaCaT inducidas por US de baja intensidad de 1 MHz se estimaron en términos de la eficiencia de captación de la sonda verde fluorescente calceína. Dado que las membranas intactas son impermeables a la calceína, ésta representa un marcador fiable de SP. El porcentaje de células verdes positivas se cuantificó mediante análisis de citometría de flujo de acuerdo con la Sección 2.5.

Para evaluar la sensibilidad de la permeabilidad de la membrana al tiempo de exposición al US, se utilizó una Ispta de US muy baja. En particular, ya una Ispta de 7 ± 1 mW/cm2 puede desencadenar efectos significativos en la permeabilidad de la membrana mediante tiempos de exposición adecuados. Los resultados representativos de la investigación paralela de citometría de flujo en células HaCaT y NIH-3T3, ambas sonicadas a Ispta ~7 mW/cm2 durante 5′, 15′, 30′ y 45′, se muestran en la Fig. 1 (triángulos rojos y cuadrados azules, respectivamente). Como era de esperar, la comparación entre líneas celulares tras tiempos de sonicación bajos (por debajo del umbral de sonoporación) da como resultado una escasa afinidad de la calceína, en la que las diferencias (la más alta en las células HaCaT) deberían dar cuenta de sus respectivas características de composición y permeabilidad de la membrana. Más importante aún, ambas líneas celulares muestran un aumento significativo de la eficiencia de captación a partir de los 15′ de exposición, lo que corresponde a una dosis de sonicación de (6,3 ± 0,9) J/cm2, lo que sugiere la activación del proceso de SP. Según los mejores ajustes de la Fig. 1, para tiempos de exposición más largos, nuestros experimentos señalan una correlación lineal entre la eficiencia de captación y el tiempo de exposición, con una tasa de captación idéntica inducida por US en las células HaCaT y NIH-3T3 (pendientes de regresión lineal (%/min) 1,3 ± 0,2, y 1,4 ± 0,2, para HaCaT y NIH-3T3, respectivamente). Esto significaría que el aumento de la eficiencia de captación debido a la SP es un fenómeno independiente de la línea celular.

Para investigar más a fondo el proceso de SP y caracterizar la internalización, las células HaCaT tratadas se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia. En consonancia con los resultados de la citometría de flujo, las muestras sonicadas durante 5′ no muestran ninguna alteración significativa en la permeabilidad de la membrana con respecto a la muestra de control (no tratada), mientras que a partir de 15′ se observa una eficiencia de captación creciente (como se muestra en la Fig. 2 y en la Figura S2 de ESI) aunque no todas las células mostraron fluorescencia. En consecuencia, las células parecen menos densas y adherentes con respecto a la muestra de control, lo que sugiere un aflojamiento de las uniones estrechas. Las imágenes representativas de la Fig. 2 sugieren una localización heterogénea de la calceína dentro de las células, y de hecho la microscopía de fluorescencia confocal permitió distinguir claramente dentro de las células HaCaT la distribución periférica de la sonda de la interna (ver imagen y reconstrucciones 3D de la Fig. 3). En la sección 3 de la ESI se muestran imágenes más detalladas. Las observaciones son consistentes con una captación de la fluorosonda en dos niveles: uno periférico, en el que la sonda se localiza en la red del retículo endoplásmico alrededor de la membrana plasmática; el otro, exhibido significativamente después de la exposición de 30′, en el que la difusión de la sonda en el citoplasma provoca una intensa fluorescencia distribuida uniformemente por toda la célula, incluyendo el nucleoplasma. Cabe destacar que el diámetro de Stokes de la calceína es de ~1,36 nm y su transporte intranuclear no se ve obstaculizado por barreras difusivas29. Un análisis más completo reportado en las secciones 3.2 y 3.3 permite concluir que la dosis de exposición de US y el peso molecular de la sonda fueron factores dominantes en la determinación de la captación.

Se realizó otro ensayo basado en la fluorosonda roja PI para evaluar la recuperación de la permeabilidad de la membrana nativa de las células sonicadas (véase también la sección 2.3). La internalización de PI denota la activación de procesos citotóxicos. La co-localización de los colorantes verde y rojo en el interior de las células indica, por tanto, el fracaso del proceso de recuperación de la membrana tras la SP. Por otro lado, la observación en las células de la fluorescencia verde en ausencia de la roja señala la ocurrencia de SP de membrana durante el tratamiento con US y su exitosa recuperación tras la desconexión del campo. En la Fig. 4 se muestran imágenes de fluorescencia confocal representativas. La co-localización de los dos colorantes está ausente en las células tratadas durante 15′, mientras que apenas se observa tras 30′ de exposición (Figura S5 de ESI). Consistentemente, se reveló una pérdida neta de viabilidad de ~5%, como se comprobó por citometría de flujo. En las células sonicadas durante 45′, correspondientes a una dosis de (19 ± 3) J/cm2, la co-localización parece más evidente (ver flechas blancas en la Fig. 4B) y se produce una pérdida de viabilidad más significativa (~10%, como se comprueba por citometría de flujo). Estos resultados sugieren que un tiempo de exposición más largo, correspondiente a una dosis más alta a Ispta fija, induce una alteración irreversible en la estructura de la membrana seguida de una consecuente respuesta citotóxica.

Análisis de la influencia de la intensidad de US

Se analizó el efecto de la variación de la intensidad del campo de US aplicado sobre la permeabilidad de la membrana en la línea celular HaCaT después de 15′ de exposición, tiempo suficiente para excluir los efectos inducidos por una sonicación de larga duración. En nuestro estudio, las intensidades de los EE.UU. estaban en el rango entre Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 e Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, muy por debajo del umbral de cavitación24. Según el protocolo descrito en las secciones 2.3 y 2.5, se utilizaron dextranos marcados con FITC de diferentes MW (MW = 10, 40 y 70 kDa) para caracterizar, para cada intensidad de US, la inducción de la permeabilidad de la membrana al diferente tamaño de la molécula. Este procedimiento permite a su vez evaluar el tamaño del sonoporo. Al igual que la calceína, los dextranos no entran significativamente en las células no tratadas31,32, mientras que en el régimen de US de cavitación la captación celular de dextranos marcados con FITC puede incrementarse fuertemente tanto por la SP como por la promoción del tráfico endosomal30. En este sentido, los resultados de las mediciones de citometría de flujo reportados en la Fig. 5 muestran claramente una captación dependiente del tamaño, un fenómeno que nos permite excluir la concomitancia de efectos de endocitosis activa y, de acuerdo con la literatura22, sugiere la SP desencadenada por baja intensidad como el principal mecanismo involucrado en el transporte de moléculas de dextrano a través de la membrana plasmática. En concreto, la captación inducida por SP observada se caracteriza por un umbral Ispta, que aumenta linealmente con el incremento del MW de las moléculas internalizadas. Por debajo de este umbral, la eficiencia de captación de las células tratadas es comparable a la de las no expuestas. Los valores del umbral Ispta se indican en la Tabla 1. Para intensidades superiores al umbral, la eficacia de captación aumenta con el incremento de Ispta hasta alcanzar un máximo. Para el dextrano de 10 kDa, entonces disminuye ligeramente hasta llegar a una meseta. La disminución observada de la eficacia de captación a intensidades elevadas puede explicarse por el aumento del número de células muertas, que se eliminan de la muestra al enjuagar, por lo que no contribuyen a los análisis de citometría de flujo. Además, la activación de los procesos apoptóticos podría dificultar la internalización del colorante. En particular, para Ispta = 15 mW/cm2 aunque este valor es muy inferior al umbral de cavitación, las células son capaces de internalizar dextranos de 70 kDa, con un diámetro de Stokes de ~12 nm. Este valor puede tomarse como una estimación del tamaño mínimo de los sonoporos producidos en la membrana. En la Figura S6 (Sección 4 de ESI) se reporta un conjunto de imágenes de fluorescencia representativas que exhiben la captación de dextranos en el umbral Ispta junto con el ensayo PI.

La internalización de PI señala una respuesta citotóxica significativa a Ispta = 15 mW/cm2 (dosis de exposición 13,5 J/cm2). Como informaron Udroiu et al.13 en condiciones experimentales similares, también se observó un ligero pero significativo aumento de la incidencia de micronúcleos en las células NIH-3T3, dependiendo de la intensidad y el tiempo de exposición a 1 MHz US. Estas observaciones sugirieron que era necesario realizar más estudios para comprender mejor los bioefectos que acompañan a la SP de membrana y, por lo tanto, se llevó a cabo un estudio de la respuesta biológica de las células sonicadas en función de la intensidad de la US.

La respuesta biológica a las «heridas de membrana» inducidas por la SP mediante intensidades de US muy bajas se caracterizó exhaustivamente mediante la evaluación de la muerte celular, utilizando el ensayo combinado de AnnexinV y PI descrito en la sección 2.5 (véase también la sección 5 de ESI). También se evaluó la expresión del gen IL-6, una citoquina que relaciona la inflamación crónica con el cáncer33,34. Los resultados del análisis de citometría de flujo, expresados en términos de porcentaje celular, se presentan en la Fig. 6. La viabilidad celular se conserva principalmente (>90%) durante los tratamientos de 15′, sin embargo, a partir de Ispta = 9 mW/cm2 se produce un ligero descenso, acompañado de un aumento de las células apoptóticas tempranas. A Ispta = 14 mW/cm2 comienza a observarse un porcentaje significativo de células necróticas, mientras que a Ispta = 16 mW/cm2 también la apoptosis tardía contribuye a la muerte celular, en correspondencia con una ligera reducción de la necrosis (gráficos de citometría de flujo representativos en la Figura S7 de ESI). La expresión del gen de la IL-6 se determinó mediante RT-PCR (Fig. 7). No se observó ninguna regulación al alza para Ispta ≤15 mW/cm2 mientras que el tratamiento a 16 mW/cm2 indujo una sobreexpresión de este gen en comparación con el de las células no tratadas.

Estos hallazgos sugieren que, a partir de un umbral de Ispta de 16 mW/cm2 y 15′ de sonicación, el daño de la membrana causado por US no sólo disminuye la viabilidad de las células sino que también, a través de la sobreexpresión del gen relacionado con la inflamación IL-6, podría inducir una respuesta inflamatoria. Dado que varias investigaciones han reconocido un papel de la inflamación en la promoción de la patogénesis y la progresión de enfermedades como el cáncer35,36, es necesario seguir investigando para caracterizar mejor los aspectos relacionados con los patrones inflamatorios.

Análisis de la influencia de la dosis de sonicación

Para analizar cuantitativamente la relación entre el campo US aplicado y los efectos biológicos observados en términos de la energía entregada a las células durante la exposición, se calculó la dosis de sonicación para cada tratamiento como el producto de la intensidad Ispta por el tiempo de exposición. Los valores obtenidos se presentan en la Tabla 2, donde los efectos biológicos observados se identifican con colores de fondo. Nuestros resultados sugieren que la SP de la membrana se produce a partir de una dosis umbral de unos 6,3 J/cm2. Además, el tamaño de los sonoporos puede estar relacionado con la dosis de sonicación. Para dosis superiores a 10,8 J/cm2 se observa una disminución de la viabilidad y eventos concomitantes de apoptosis temprana en la célula tratada, seguidos a partir de 14,4 J/cm2 por apoptosis tardía, necrosis y sobreexpresión de IL-6.

Subrayamos que esta dosis, e Ispta 16 mW/cm2, corresponde a una presión máxima negativa de ~0,02 MPa. Este valor parece lo suficientemente alto como para inducir una tensión mecánica en la interfaz membrana plasmática/agua, aunque cae un orden de magnitud por debajo del valor del umbral de exposición de seguridad sugerido hasta ahora (índice mecánico ~0,2-0,3, a 1 MHz).

Nótese que nuestros experimentos se compararon con éxito con los realizados mediante el uso de un sistema electromédico realmente empleado en la terapia de Estados Unidos (véase también la sección 2.2), destacando así la relevancia médica de nuestro enfoque. En este sentido, estamos seguros de que proporcionar información sobre la dosis de sonicación (a la frecuencia fija de US) permite un índice más completo de caracterización de la respuesta celular a la exposición de US y, a su vez, una identificación fina de un rango de parámetros donde se produce SP transitorio con daños biológicos insignificantes.

Un paso muy importante hacia la comprensión del impacto biológico in vivo de nuestros resultados sería operar con exposiciones de US en biosistemas tridimensionales, tales como tejidos humanos compuestos por queratinocitos multiapilados o por células endoteliales de la barrera hematoencefálica.