Cribado por inmunoensayo de difenhidramina (Benadryl®) en orina y sangre Utilizando un ensayo recientemente desarrollado

Abstract

La difenhidramina (DPH) es un antihistamínico común de venta libre que produce somnolencia y tiene el potencial de causar accidentes relacionados con la conducción bajo la influencia de drogas.de drogas. Hasta la fecha no existen kits de inmunoensayo disponibles en el mercado para su detección en fluidos biológicos como la orina y/o la sangre. Describimos un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) recientemente desarrollado e informamos sobre su utilidad en el análisis de muestras auténticas tomadas de voluntarios. El ensayo es específico para la detección de DPH y no detecta antihistamínicos estrechamente relacionados como la bromfeniramina, la clorfeniramina y la doxilamina. Se observa una cantidad variable de reactividad cruzada con ciertos compuestos tricíclicos, debido a las similitudes en la estructura de la cadena lateral con el DPH. Se determinó que la precisión intra e interdiaria del ensayo es inferior al 10%. El ensayo es altamente sensible y tiene un rango de trabajo de 1 a 500 ng/mL para la orina y de 1 a 250 ng/mL para la sangre. El ensayo se validó además con muestras auténticas de orina y sangre obtenidas de voluntarios y laboratorios forenses.

Introducción

La difenhidramina (DPH), 2-difenilmetoxi-N,N-dimetilanamina, es un antihistamínico a base de etanolamina. Fue uno de los primeros agentes antihistamínicos descubiertos en 1946 y se toma ampliamente para aliviar los síntomas comunes de la alergia. El DPH ejerce su acción bloqueando los efectos de la histamina en los receptores H1 y también es un inhibidor del CYP2D6 y un depresor del sistema nervioso central (SNC). Además de ser un antihistamínico, también se utiliza como antiemético, antitusivo y sedante. Aunque es eficaz, el DPH tiene varios efectos secundarios que incluyen somnolencia, alteraciones motoras, taquicardia y visión borrosa, entre otros (1, 2), por lo que se ha señalado como factor de riesgo en situaciones de conducción peligrosa (3-5). Las interacciones del DPH con otros medicamentos y/o con el alcohol, podrían aumentar aún más el riesgo de accidentes y muertes relacionadas con la conducción.

Los antihistamínicos se clasifican a grandes rasgos en antihistamínicos de primera generación, de segunda generación y de prescripción. Los antihistamínicos de primera generación, entre los que se encuentra el DPH (Benadryl™), son todos de venta libre y provocan una marcada somnolencia. Los antihistamínicos relacionados con esta clase son la clorfeniramina (Singlet™), la bromfeniramina (Dimetapp™) y la doxilamina (Vicks NyQuil™). Otro antihistamínico de primera generación es la sal de 8-cloroteofilinato de DPH, conocida como dimenhidrinato (Dramamine™), que se prescribe para el mareo. Los antihistamínicos de segunda generación son la loratadina (Claritin™), la desloratadina (Clarinex™), la acrivastina (Semprex-D™), la ebastina (Kestine™), la cetirizina (Zyrtec™) y la fexofenadina (Allegra™), que son alternativas al DPH que no producen somnolencia. La figura 1 muestra las estructuras químicas de los antihistamínicos más comunes.

Los efectos inductores del sueño del DPH han dado lugar a su combinación con otros medicamentos como el paracetamol, en formulaciones como Tylenol PM™, o con descongestionantes nasales como la pseudoefedrina. Aunque el DPH es uno de los antihistamínicos más antiguos, se puede adquirir fácilmente sin receta y es más eficaz y de acción rápida que algunos de los últimos medicamentos de venta con receta, de ahí su uso generalizado (6). La etiqueta de advertencia del Benadryl indica claramente el peligro de conducir después de tomar el medicamento. Además, numerosos estudios han demostrado claramente el deterioro de las habilidades motoras y del rendimiento cognitivo asociado a la compleja tarea de manejar automóviles después de tomar DPH frente a un antihistamínico de segunda generación o incluso al alcohol (7-12). También se ha realizado un estudio sobre el mayor riesgo de lesiones tras tomar DPH en comparación con los antihistamínicos de segunda generación (13). Estos estudios racionalizarían claramente la importancia de realizar pruebas principalmente de DPH.

El DPH está disponible en varias formas de dosificación, incluyendo líquido, comprimidos, cápsulas, chicles y cremas tópicas. La dosis sugerida para los adultos está en el rango de 25-50 mg cada 4-6 h, sin superar los 50-100 mg (1). Cuando se toma el DPH, el organismo lo absorbe rápidamente, observándose una actividad máxima aproximadamente una hora después de tomar el medicamento. La vida media del DPH es de unas 2-9 horas, alcanzándose las concentraciones plasmáticas máximas tras unas 1-4 horas después de tomar la dosis. Tras una dosis oral única de 50 mg, se detectaron concentraciones plasmáticas máximas medias de 83 ng/mL de difenhidramina al cabo de 3 h, que luego disminuyeron a 9 ng/mL a las 24 h (14). Una sola dosis oral de 100 mg de DPH dio lugar a concentraciones plasmáticas máximas promedio de 112 ng/mL a las 2 h después de la dosis (15). La eficacia de los antihistamínicos se observa en concentraciones superiores a 25 ng/mL, la somnolencia puede observarse a 30-40 ng/mL y el deterioro mental se observa con concentraciones superiores a 60 ng/mL (16). Se ha informado que los niveles terapéuticos de DPH en la sangre oscilan entre 25 y 112 ng/mL, los niveles tóxicos son de alrededor de 5000 ng/mL, y los niveles letales son superiores a 8000 ng/mL (3, 17). También se han documentado varios casos de abuso de DPH a lo largo de muchos años (18-20).

El metabolismo in vivo del DPH da lugar a que aproximadamente el 30% de la dosis se convierta en el metabolito N-desmetil, seguido de la formación del metabolito N,N-didesmetil y el 13% de la dosis se convierte en metabolitos acetilos a través de la amina. Un pequeño porcentaje se convierte en ácido difenilmetoacético y el porcentaje restante de la dosis se excreta sin cambios como fármaco principal (21, 22). El metabolismo de la difenhidramina se describe en la figura 2.

Los métodos tradicionales de análisis de DPH en plasma humano han implicado una extracción de muestras costosa y que requiere mucho tiempo, seguida de procedimientos de confirmación. Varios grupos han informado del uso de varios métodos de cromatografía de gases (GC) para la detección de DPH en plasma y orina (23-27). También se ha informado sobre métodos de electroforesis capilar (28) y de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) (29) que se han desarrollado para la detección de DPH. Hasta ahora, no hay informes en la literatura sobre la detección de difenhidramina mediante ELISA o cualquier otro método de inmunoensayo. En esta publicación, informamos sobre el primer método de cribado ELISA para DPH en orina y sangre humana.

Se considera una práctica estándar en los laboratorios de toxicología realizar un cribado por inmunoensayo, en el que las muestras positivas se identifican primero y se confirman posteriormente mediante técnicas de GC-MS o LC-MS. La mayoría de los laboratorios de toxicología emplean esta estrategia de «coste-beneficio», en lugar de llevar a cabo un procedimiento de confirmación más caro en cada muestra recibida. Por lo tanto, sería útil disponer de un método de cribado ELISA fiable para aplicarlo a las muestras del DPH relacionadas con los accidentes de tráfico y las víctimas mortales. Con este objetivo, los toxicólogos han presentado recomendaciones para el DUID, incluyendo una propuesta de límite de DPH de 25 ng/mL en sangre y 50 ng/mL en orina (30). Este trabajo describe un método de cribado ELISA robusto y preciso para DPH en orina y sangre humana siguiendo estas directrices propuestas.

Experimental

Materiales

Reactivos y productos químicos. La difenhidramina se obtuvo de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), y la difenhidramina-d3 (solución de 100 μg/mL en metanol) se obtuvo de Cerilliant (Round Rock, TX). El anticuerpo policlonal específico de DPH fue criado por Immunalysis (Pomona, CA), y los haptenos de DPH y los conjugados marcados con peroxidasa de rábano picante fueron sintetizados en Immunalysis. El reactivo de sustrato 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) utilizado para la reacción colorimétrica se obtuvo de Pierce (Rockford, IL). Las enzimas utilizadas en el proceso fueron tiroglobulina bovina (BTG) obtenida de Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), peroxidasa de rábano picante (HRP) obtenida de BBI Enzymes (Madison, WI), y albúmina de suero bovino (BSA) obtenida de Proliant Biologicals (Boone, IA). Todos los disolventes utilizados eran de grado HPLC, y todos los productos químicos eran de grado ACS y se obtuvieron de Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Para ELISA, los calibradores altos para DPH a 1000 ng/mL se prepararon en orina sintética negativa y sangre sintética negativa y se almacenaron a 4°C. La orina negativa sintética y la sangre negativa sintética utilizadas en este ensayo se han formulado con ingredientes que se encuentran en esas matrices respectivas y coinciden con las respuestas de inmunoensayo de tres especímenes de orina y sangre humanas negativas (31, 32). La orina negativa sintética consiste en una solución de BSA al 0,1% en agua desionizada; con 0,2% de colorante amarillo FD&C #6, y la sangre negativa sintética consiste en una formulación propia de Immunalysis.

Aparato. Las columnas de afinidad HiTrap protein G HP que se utilizaron para la purificación de la inmunoglobulina G (IgG) se compraron a GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Las placas de microtitulación de poliestireno estándar (96 pocillos) se obtuvieron de Corning Costar (Corning, NY). Un lavador de placas de microtitulación Tecan Columbus Pro y un lector de placas Tecan Sunrise se obtuvieron de Tecan (San José, CA). Las pipetas que se utilizaron durante el proceso de desarrollo del inmunoensayo se obtuvieron de Rainin Instruments (Oakland, CA). Un MS 6410 de triple cuadrupolo y la columna Zorbax Eclipse XDB C18 utilizada para el análisis LC-MS-MS se adquirieron de Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Métodos

ELISA. El paso principal en el desarrollo del método ELISA implicó la generación de anticuerpos policlonales que se basaron en la respuesta inmunoquímica de una especie animal seleccionada a un antígeno específico del DPH. Para lograr este objetivo, primero se inmunizaron conejos con un antígeno de DPH consistente en DPH conjugado con tiroglobulina bovina (BTG). El proceso de inmunización y sangrado de los conejos se contrató a un centro especializado en animales. El suero obtenido de los conejos se purificó internamente mediante cromatografía de afinidad por elución a través de columnas de proteína G, para obtener la fracción de IgG purificada. A continuación, la IgG policlonal específica de DPH se inmovilizó en placas de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos. Se aspiró el exceso de anticuerpo, se bloquearon los sitios de unión del anticuerpo libre con una solución de trehalosa al 1% en agua y, a continuación, se secaron las placas en una estufa de vacío a 37°C durante la noche. Las placas se almacenaron además en una bolsa sellada con desecante, ya que es fundamental mantenerlas libres de humedad. Primero se preparó una curva dosis-respuesta de DPH en orina fortificando la orina sintética negativa a 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 y 500 ng/mL a partir de la solución madre calibradora alta de la droga. La curva de sangre se obtuvo fortificando la sangre sintética negativa a 1, 5, 10, 25, 50, 100 y 250 ng/mL a partir de la solución calibradora alta. Estos calibradores en sangre sintética se diluyeron además 1:10 con tampón fosfato 100 mM que contenía 150 mM de cloruro sódico (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,0) antes del análisis. Todas las muestras de sangre se diluyeron de forma similar 1:10 con solución salina tamponada con fosfato (pH 7,0). Las muestras de orina también se diluyeron 1:20 con solución salina tamponada con fosfato 100 mM (pH 7,0). Los calibradores y las muestras se pipetearon por duplicado en los pozos de la placa de microtitulación, utilizando un tamaño de muestra de 10 μL tanto para la orina como para la sangre. A continuación se añadieron 100 μL de conjugado enzimático consistente en difenhidramina marcada con HRP. La placa se dejó incubar durante 1 hora en la oscuridad, a temperatura ambiente. A continuación, los pocillos se lavaron seis veces con 350 μL de agua desionizada utilizando un lavador de placas de microtitulación, se aspiraron para eliminar el agua y, a continuación, se invirtieron y se secaron con una palmada para eliminar el agua residual de los pocillos. A continuación, se añadió el sustrato cromogénico TMB (100 μL) a cada pocillo y se incubó la placa durante otros 30 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo con 100 μL de ácido clorhídrico 1 N, para producir un color amarillo. El ensayo es colorimétrico y la absorbancia se leyó a una longitud de onda dual de 450 nm y 650 nm utilizando un lector de placas de microtitulación. La longitud de onda de 650 nm mide la absorbancia de fondo, que el lector de placas resta de la absorbancia final. La intensidad del color producido es inversamente proporcional a la concentración de analito en la muestra.

LC-MS-MS. Para el análisis se utilizó una bomba de LC de la serie 1200 acoplada a una MS de triple cuadrupolo 6410 que operaba en modo de ionización por electrospray positivo (ESI). La columna de LC-MS-MS utilizada fue una Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). La muestra para el análisis se preparó de la siguiente manera: una muestra de orina de 100 µl que contenía 50 µl de difenhidramina-d3 (200 ng/mL) se añadió a un vial del automuestreador. Las muestras se inyectaron directamente en el LC-MS-MS mediante un autoinyector. La temperatura de la columna se mantuvo a 60°C y el volumen de inyección fue de 5 µL. La fase móvil consistía en ácido acético al 0,2% con pH 4 (disolvente A) y metanol (disolvente B). Inicialmente, la composición de la fase móvil fue del 100% de A a un flujo de 0,7 mL/min durante un período de 6 min, luego se aumentó el porcentaje de metanol al 100%, y luego se volvió de nuevo al 100% de A después de 7 min.

La temperatura del gas fue de 350°C, el flujo de gas fue de 10 L/min, y la presión del nebulizador se mantuvo a 50 psi. Se utilizó nitrógeno como gas de colisión, y el voltaje capilar fue de 4000V. Se seleccionaron y optimizaron dos transiciones para cada fármaco. El tiempo de permanencia fue de 50 ms, y la energía óptima del fragmentador fue de 80V para todas las transiciones. Se determinó que los voltajes óptimos de energía de colisión eran 35V para el estándar interno deuterado (difenhidramina-d3), 15V para la transición primaria y 30V para la transición secundaria de la propia difenhidramina. La relación entre la transición calificadora y la cuantificadora se determinó aproximadamente en el punto medio del rango de calibración: 100 ng/mL. La transición para la difenhidramina-d3 fue de 259,7 > 165,2; la transición primaria (cuantificadora) para la difenhidramina fue de 256,7 > 167,2; la transición calificadora (secundaria) 256,7 > 152,2. La difenhidramina no marcada puede descomponerse en iones producto de m/z 167 o 165 a partir del ion precursor, dependiendo de la energía de colisión aplicada. Nuestro procedimiento fue validado utilizando las condiciones descritas. El límite de detección (LOD) del método LC-MS-MS fue de 10 ng/mL y se determinó que era la menor concentración detectable con una relación señal/ruido > 2.

Resultados y discusión

Curva dosis-respuesta

El método utiliza la unión competitiva entre el conjugado enzimático y el analito libre en la muestra para una cantidad fija de sitios de unión del anticuerpo, proporcional a su concentración en la mezcla. Las curvas dosis-respuesta para DPH se prepararon en orina sintética negativa y sangre sintética negativa a las concentraciones descritas anteriormente. B0 es la absorbencia del calibrador negativo, y B representa la absorbencia de los niveles individuales del calibrador. La relación porcentual entre el calibrador individual y el calibrador negativo (B/B0) se calculó para cada nivel de calibrador y se representó gráficamente frente a la concentración del fármaco (ng/mL) tanto para la orina como para la sangre (Figura 3). Los valores B/B0 son inversamente proporcionales a la concentración de fármaco en la muestra, ya que cuanto mayor es la concentración de fármaco, menos conjugado fármaco-enzima se une al anticuerpo, produciendo así un valor de absorbancia menor.

LOD y corte

El LOD del ensayo de DPH se determinó como la concentración más baja que puede medirse con precisión utilizando los parámetros descritos para el ensayo. Se enriquecieron tres muestras de orina auténtica sin drogas con concentraciones variables de DPH hasta 1 ng/mL y luego se analizaron por duplicado. Se obtuvo el valor más bajo calculado a partir de dos desviaciones estándar y, basándose en este resultado, se determinó que el LOD para el ensayo era de 1 ng/mL. Las concentraciones de corte fueron diseñadas para ser de 50 ng/mL para la orina y fue de 25 ng/mL para la sangre. Ambos se establecieron como los puntos de decisión óptimos basados en dos desviaciones estándar de los calibradores en la parte lineal de la curva dosis-respuesta, así como teniendo en cuenta las directrices recomendadas establecidas por el campo de la toxicología.

Selectividad

La interferencia de compuestos relacionados y no relacionados se estudió añadiendo estas sustancias en orina sintética negativa y ejecutándolas en el ensayo ELISA. La Tabla I muestra los datos de reactividad cruzada con los compuestos estrechamente relacionados en estructura y actividad farmacológica con la difenhidramina, que resultaron ser iguales o inferiores al 1% en el punto de corte del ensayo de 50 ng/mL. La orfenadrina, que es un relajante muscular así como un agente antihistamínico, reaccionó de forma cruzada con el ensayo en un 42% porque tiene una estructura muy similar a la DPH, aunque con un grupo sustituto del metilo. Ninguno de los metabolitos del DPH que se muestran en la Figura 2 se examinó como reactivo cruzado en este ensayo porque no estaban disponibles comercialmente en ese momento.

También se analizaron compuestos no relacionados con el DPH a concentraciones de 100.000 ng/mL en el ensayo. La Tabla II muestra la reactividad cruzada con estos compuestos no relacionados. La mayoría de estos compuestos no interfirieron con la detección de DPH en el ensayo. Debido a las similitudes en la estructura de la cadena lateral, varios compuestos como la amitriptilina, la clorpromazina, la clomipramina, la doxepina, la imipramina y la ciclobenzaprina mostraron diversos grados de reactividad cruzada con el ensayo. Los métodos de confirmación descartarían preferentemente cualquier falso positivo detectado por el ELISA como resultado de estos reactivos cruzados que podrían interferir con el ensayo de DPH. También se estudiaron los efectos de la matriz de muestras auténticas de orina y sangre sin DPH para determinar sus efectos en el ensayo. No se observaron resultados falsos positivos indeseables debidos a las matrices de orina y sangre cuando se examinaron con el ensayo muestras de orina y sangre sin DPH confirmadas por LC-MS-MS.

Precisión

Las precisiones intradía e interdía del ELISA se realizaron sólo en orina sintética a concentraciones de 0, 5, 10, 25 y 50 ng/mL. La precisión intradía se calculó como coeficiente de variación (CV%) a partir de 8 análisis realizados el mismo día (n = 8) y fue inferior al 10%, y la precisión interdiaria (CV%) calculada a partir de 8 análisis por día durante 10 días (n = 80) y también resultó ser inferior al 10%. Los datos se muestran en la Tabla III.

Estabilidad y vida útil del ensayo

La vida útil de un producto puede definirse como el tiempo que se mantienen las características esenciales de funcionamiento en condiciones específicas de manipulación (33). Con el fin de cumplir este requisito para los reactivos clínicos, se realizó un estudio de prueba de estabilidad acelerada para determinar la vida útil aproximada del producto comercial. El conjugado enzimático DPH-HRP se estresó a 37°C durante un periodo de 14 días y durante ese tiempo se ensayó a intervalos y se comparó su rendimiento con el conjugado fármaco-enzima refrigerado y almacenado a 4°C. La curva dosis-respuesta se ejecutó a niveles de calibración de 10, 50 y 100 ng/mL en orina sintética durante el período de 14 días. El ensayo mostró una respuesta a la dosis casi idéntica durante todo el estudio de tiempo acelerado de 2 semanas. Este período de 14 días de pruebas de tiempo acelerado representa el equivalente de al menos 18 meses de estabilidad en tiempo real a 4°C (33). Los datos se muestran en la Figura 4.

Muestras auténticas

Para validar el ensayo, se obtuvieron muestras de orina en diferentes momentos durante un período de una semana de cinco voluntarios que son usuarios terapéuticos regulares de difenhidramina debido a síntomas de alergia comunes. Se pidió a los cinco voluntarios que rellenaran un cuestionario indicando todos los medicamentos que tomaban, y se observó que no figuraba ninguna otra medicación. Se recogieron 20 especímenes y se analizaron primero mediante ELISA y luego se confirmaron mediante LC-MS-MS. Todas las muestras de orina se diluyeron previamente en una proporción de 1:20 con solución salina tamponada con fosfato 100 mM (pH 7,0) antes de realizar el ELISA. Seis especímenes resultaron negativos por ambos métodos, mientras que 14 especímenes fueron positivos por ELISA, de los cuales 1 espécimen fue confirmado como negativo por LC-MS-MS. Esto podría deberse a que la cantidad de DPH presente en ese espécimen según la LC-MS-MS estaba cerca del límite de 50 ng/mL. Las muestras de orina positivas contenían DPH entre niveles de 60 y 700 ng/mL. También se prepararon diez muestras de orina de control fortificando la orina negativa sintética con concentraciones positivas bajas y altas de difenhidramina y se analizaron posteriormente en el ensayo. Los resultados fueron todos positivos por ELISA y se correlacionaron con sus datos de confirmación por LC-MS-MS.

Se utilizaron especímenes postmortem para la validación del ensayo en sangre. Se obtuvieron 20 muestras de sangre postmortem del laboratorio forense del condado de Los Ángeles. Todos los especímenes de sangre fueron pre-diluidos 1:10 con 100 mM de solución salina tamponada con fosfato (pH 7.0) antes del análisis. Las 20 muestras dieron positivo por ELISA y se compararon con sus datos de confirmación por GC-MS, también proporcionados por el laboratorio forense, que mostraron que contenían una amplia gama de concentraciones de DPH entre < 100 y 870 ng/mL. Aunque un espécimen confirmó menos del límite de cuantificación por GC-MS de 100 ng/mL, el DPH se identificó igualmente mediante el procedimiento ELISA. El objetivo de este estudio era validar el método ELISA con un procedimiento de confirmación conocido y no intentar interpretar las concentraciones. La conclusión de este estudio es que el ensayo ELISA es capaz de detectar niveles terapéuticos de DPH, así como niveles postmortem mucho más altos, y por lo tanto podría utilizarse fácilmente para fines de cribado de DUID, así como para casos de fatalidad.

Conclusiones

El DPH es un medicamento de venta libre que se ha relacionado con numerosos accidentes relacionados con la conducción, así como con fatalidades. Por ello, una prueba ELISA sería útil para determinar la presencia de medicamentos de venta libre, como los antihistamínicos, en muestras obtenidas en situaciones relacionadas con la conducción. Este artículo describe el desarrollo de un método de cribado ELISA altamente sensible y específico para la difenhidramina en matrices de orina y sangre con una precisión <10%. Según el conocimiento de los autores, este es el primer método de inmunoensayo desarrollado para la detección de DPH en fluidos corporales humanos. Este método sigue las directrices recomendadas sobre un punto de corte de 50 ng/mL en orina y 25 ng/mL en sangre para los casos de DUID. La validez del método también se verificó con especímenes auténticos de orina y sangre, y los datos de ELISA se correlacionaron con los resultados de confirmación de LC-MS-MS y GC-MS. Aunque algunas de las muestras analizadas procedían de casos postmortem, los resultados obtenidos con ellas, combinados con el bajo LOD del ensayo, demuestran claramente la aplicabilidad del ensayo a los casos de deterioro en carretera, en los que podrían detectarse cantidades menores de DPH. Se observó cierto grado de reactividad cruzada con ciertos compuestos tricíclicos que son estructuralmente similares al DPH; sin embargo, cualquier falso positivo resultante de tales compuestos se eliminaría en la etapa de confirmación. Es necesario realizar más estudios para eliminar los problemas de reactividad cruzada con los compuestos tricíclicos y mejorar la de los antihistamínicos similares.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la financiación de Immunalysis Corporation. Nos gustaría dar las gracias al Dr. James Soares y al Sr. Michael Vincent por sus perspicaces discusiones durante la preparación de este manuscrito, a la Sra. Cynthia Coulter por el análisis LC-MS-MS de las muestras de orina, y al Sr. Dan Anderson del laboratorio forense del condado de Los Ángeles por proporcionar muestras de sangre positivas. También deseamos agradecer a todos los voluntarios que proporcionaron muestras de orina.

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