Células madre del líquido amniótico y de la membrana amniótica: Marker Discovery

Abstract

El líquido amniótico (FA) y la membrana amniótica (MA) se han caracterizado recientemente como fuentes prometedoras de células madre o progenitoras. Ambas no sólo contienen subpoblaciones con características de células madre que se asemejan a las células madre adultas, como las células madre mesenquimales, sino que también presentan algunas propiedades de las células madre embrionarias como (i) expresión de marcadores de pluripotencia, (ii) alta expansión in vitro, o (iii) capacidad de diferenciación multilinaje. Los esfuerzos recientes se han centrado en el aislamiento y la caracterización detallada de estos tipos de células madre. Sin embargo, las variaciones en su fenotipo, su heterogeneidad descrita por diferentes grupos y la ausencia de un único marcador que se exprese únicamente en estas células pueden impedir el aislamiento de una población pura y homogénea de células madre a partir de estas fuentes y su potencial uso en aplicaciones terapéuticas. En este artículo, pretendemos resumir los recientes avances en el descubrimiento de marcadores para las células madre derivadas de fuentes fetales como la FA y la AM, utilizando metodologías novedosas basadas en la transcriptómica, la proteómica o el análisis del secretoma.

1. Introducción

Tanto el líquido amniótico (FA) como la membrana amniótica (MA) representan ricas fuentes de células madre que pueden ser utilizadas en el futuro para aplicaciones terapéuticas clínicas. Los problemas éticos relacionados con el aislamiento de las células madre de estas fuentes se reducen al mínimo, al contrario de lo que ocurre con la investigación con células madre embrionarias humanas (CME). El AF se recoge durante las amniocentesis programadas entre la 15ª y la 19ª semana de gestación para el diagnóstico prenatal y el exceso de muestra puede utilizarse para la obtención de células, mientras que el AM se suele recoger durante las cesáreas de los embarazos a término. Dada la heterogeneidad de las poblaciones de células madre derivadas de estas fuentes, el aislamiento de tipos celulares específicos es difícil y requiere una caracterización fenotípica y molecular detallada de las células respectivas. Los estudios que incluyen enfoques ómicos son fundamentales para comprender mejor los mecanismos de expresión molecular de estas células y definir las metodologías correctas para su aislamiento, antes de su uso en enfoques terapéuticos.

Este trabajo tiene como objetivo presentar las principales características biológicas y moleculares de las células madre derivadas del FA y del MA y también destacar los recientes avances en el descubrimiento de marcadores utilizando metodologías globales, como la transcriptómica, la proteómica o los análisis del secretoma.

1.1. El líquido amniótico

AF sirve como líquido protector del embrión en desarrollo, proporcionando soporte mecánico y los nutrientes necesarios durante la embriogénesis . La amniocentesis se ha utilizado durante muchas décadas como procedimiento rutinario para el cariotipo fetal y el diagnóstico prenatal, permitiendo la detección de una variedad de enfermedades genéticas .

El principal componente del FA es el agua; sin embargo, su composición general varía a lo largo del embarazo. Al principio del embarazo, la osmolaridad amniótica es similar a la del plasma fetal. Tras la queratinización de la piel del feto, la osmolaridad amniótica disminuye en relación con el plasma materno o fetal, debido principalmente a la entrada de orina fetal. Lo más interesante es que el AF también representa una rica fuente de una población de células madre derivadas del feto o de la membrana amniótica circundante . Recientemente, varios grupos han realizado investigaciones adicionales sobre las propiedades celulares de las células derivadas del amniótico y su posible uso en modelos preclínicos y en terapias de trasplante.

1.1.1. Células madre del líquido amniótico Células madre del líquido amniótico (AFSCs)

Las células del líquido amniótico (AFCs) representan una población heterogénea derivada de las tres capas germinales. Estas células comparten un origen epitelial y se derivan del embrión en desarrollo o de la superficie interna de la membrana amniótica, que se caracterizan como células madre de la membrana amniótica . Las AFC están compuestas principalmente por tres grupos de células adherentes, clasificadas en función de sus características morfológicas, de crecimiento y bioquímicas . Las células epitelioides (tipo E) son células cuboidales a columnares derivadas de la piel y la orina del feto, las células del líquido amniótico (tipo AF) se originan en las membranas del feto, y las células fibroblásticas (tipo F) se generan principalmente a partir del tejido conectivo fibroso. Tanto las células de tipo AF como las de tipo F comparten una morfología fibroblastoide y el tipo celular dominante parece ser el de tipo AF, que coexpresa queratinas y vimentinas . Varios estudios han documentado que las células madre del líquido amniótico humano pueden obtenerse fácilmente a partir de una pequeña cantidad de AF del segundo trimestre, recogidas durante las amniocentesis rutinarias , un procedimiento con una tasa de aborto espontáneo que oscila entre el 0,06 y el 0,5% . Hasta la fecha, se han descrito varios protocolos de cultivo diferentes que conducen a poblaciones de células madre enriquecidas. El aislamiento de AFSC y los respectivos protocolos de cultivo fueron resumidos en una reciente revisión por Klemmt et al. y pueden ser categorizados como sigue (i) un protocolo de cultivo de un solo paso, en el que el cultivo primario se dejaba sin alterar durante 7 días o más hasta que aparecían las primeras colonias , (ii) un protocolo de cultivo de dos pasos, en el que los amniocitos, no adheridos después de 5 días en cultivo, se recogían y se expandían aún más , (iii) selección de marcadores de superficie celular para CD117 (receptor c-kit) , (iv) aislamiento mecánico de las colonias iniciales de células progenitoras mesenquimales formadas en los cultivos iniciales , y (v) cultivos de corta duración para aislar colonias fibroblastoides . La mayoría de las AFSC, aisladas siguiendo estas metodologías, compartían un fenotipo mesenquimal multipotente y mostraban un mayor potencial de proliferación y un mayor potencial de diferenciación en comparación con las MSC adultas.

1.2. Membrana amniótica (AM)

La membrana amniótica, que carece de tejido vascular, forma la mayor parte de la capa interna de la membrana fetal y está compuesta por 3 capas: (i) una monocapa epitelial formada por células epiteliales, (ii) una capa basal intermedia acelular y (iii) una capa externa de células mesenquimales, rica en células madre mesenquimales y situada muy cerca del corion . El AM se utilizó en la clínica durante muchas décadas para la curación de heridas en quemaduras, promoviendo la formación de epitelio y protegiendo contra las infecciones . Recientemente, se ha evaluado el uso de la MA como material de apósito para defectos quirúrgicos de la mucosa oral, la reconstrucción de la superficie ocular, las perforaciones de la córnea y el aumento de la vejiga. Células madre de la membrana amniótica (AMSCs)

Las células madre de la membrana amniótica (AMSCs) incluyen dos tipos, las células epiteliales amnióticas (AECs) y las células madre mesenquimales de la membrana amniótica (AM-MSCs) derivadas de las capas epiteliales y mesenquimales amnióticas, respectivamente . Ambos tipos de células se originan durante las etapas de pregastrulación del embrión en desarrollo, antes de la delineación de las tres capas germinales primarias, y son en su mayoría de naturaleza epitelial . Se han establecido diversos protocolos para el aislamiento de AECs y AM-MSCs, basados principalmente en la separación mecánica de la AM de la membrana coriónica y la posterior digestión enzimática . Las AM-MSCs presentaban una adherencia plástica y una morfología fibroblastoide, mientras que las AECs mostraban un fenotipo epitelial empedrado. Las AM-MSC compartían características fenotípicas similares a las derivadas de fuentes adultas. Lo más interesante es que las AM-MSCs, al igual que las AF-MSCs, mostraron una mayor tasa de proliferación en comparación con las MSCs derivadas de fuentes adultas y un potencial de diferenciación multilingüe en células derivadas de las tres capas germinales.

2. Inmunofenotipo

2.1. Células madre de líquido amniótico Células madre del líquido amniótico

El FA ha surgido recientemente como una fuente fetal alternativa de una variedad de células de origen celular. Aquí pretendemos resumir los marcadores clave que caracterizan a las MSCs. Hasta la fecha, las MSCs representan la subpoblación mejor caracterizada de las AFSCs. Las AF-MSCs mostraban una expresión típica de marcadores mesenquimales, como CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 y CD44, determinada por análisis de citometría de flujo . Además, estas células expresaban los antígenos HLA-ABC, mientras que la expresión de los marcadores hematopoyéticos CD34 y CD45, el marcador endotelial CD31 y el antígeno HLA-DR no se detectó. Y lo que es más importante, la mayoría de las AF-MSC cultivadas expresaban marcadores de pluripotencia como la proteína de unión al octámero 3/4 (Oct-3/4), el factor de transcripción homebox Nanog (Nanog) y el antígeno embrionario específico de la etapa 4 (SSEA-4).

También se informó de que los cultivos de amniocitos contienen una pequeña población de células positivas a CD117 (una tirosina quinasa específica para el factor de células madre presente principalmente en las ESC y en las células germinales primordiales) que pueden expandirse clonalmente en cultivo . Las propiedades de diferenciación de las AFS CD117+ se probaron por primera vez in vivo, demostrando así su identidad de células madre . Las pruebas experimentales sugieren que las AFSCs derivan de células fibroblastoides con forma de huso.

En un intento de analizar las subpoblaciones de AFSCs, nuestro grupo identificó recientemente dos poblaciones morfológicamente distintas de AFSCs de origen mesenquimal, con diferentes propiedades de proliferación y diferenciación, denominadas con forma de huso (SS) y con forma redonda (RS) . Ambas subpoblaciones expresaban marcadores de células madre mesenquimales a niveles similares. Sin embargo, se identificó que las colonias SS expresaban niveles más altos de antígenos CD90 y CD44 en comparación con las colonias RS. Células madre de la membrana amniótica (AMSCs)

Un análisis detallado del inmunofenotipo de las AMSCs reveló la expresión de antígenos, como CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , marcador de células madre estromales 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, colágeno I y III (Col1/Col3), actina muscular lisa alfa (α-SMA), CD44, vimentina (Vim), proteína de superficie de los fibroblastos (FSP) y antígeno HLA-ABC . Sin embargo, la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) se expresó en niveles muy bajos y no se detectaron las proteínas TRA-1-60, la proteína de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1), el factor de von Willebrand (vWF), la molécula de adhesión celular endotelial plaquetaria (PECAM-1), el CD3 y el HLA-DR . Una de las proteínas más abundantes encontradas en las células derivadas de AM es la laminina, que desempeña un papel clave en la diferenciación, la forma y la migración de las células y la regeneración de los tejidos . Los análisis de RT-PCR mostraron además que las AMSCs expresaban genes como Oct-3/4, la proteína de dedo de zinc 42 (zfp42 o Rex-1), la proteína del factor de células madre (SCF), la molécula de adhesión celular neural (NCAM), la nestina (NES), la proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4), la proteína de unión a GATA 4 (GATA-4) y el factor nuclear de hepatocitos 4α (HNF-4α) incluso en pasajes altos. No se detectaron los transcritos de braquiuria, factor de crecimiento de fibroblastos 5 (FGF5), proteína de caja emparejada (Pax-6) y proteína morfogenética ósea 2 (BMP2). Asimismo, las CEA eran positivas para las expresiones CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1 y HLA-ABC, y negativas para las expresiones CD14, CD34, CD45, CD49d y HLA-DR, según los análisis FACS. Otras investigaciones mostraron que las CEAs expresaban marcadores de células madre como SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, región determinante del sexo Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 y Tra1-80, factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4), Rex-1, proteína críptica (CFC-1) y prominina 1 (PROM-1).

3. Transcriptómica

3.1. Células madre de líquido amniótico

Un análisis funcional de la firma de expresión génica de las MSC de AF en comparación con las de médula ósea (BM), sangre de cordón umbilical (CB) y MSC de AM fue realizado inicialmente por Tsai et al. . Los genes expresados en las MSC de las tres fuentes podían clasificarse en grupos relacionados con (i) la remodelación de la matriz extracelular (CD44, colágeno II (COL2), factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2) y el inhibidor tisular de la metaloproteinasa 1 (TIMP1)), (ii) la regulación del citoesqueleto (activador del plasminógeno tipo uroquinasa (PLAU) y receptor (PLAUR)), (iii) la regulación de las quimiocinas y la adhesión (alfa actinina 1 (ACTN1), subunidad 1B del complejo proteico relacionado con la actina (ARPC1B) y trombospondina 1 (THBS1)), (iv) activación de la plasmina (inhibidor de la vía del factor tisular 2 (TFPI2)), (v) señalización del receptor del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) (caveolina 1 (Cav1), caveolina 2 (Cav2), inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 1A (CDKN1A)), y (vi) genes que codifican ubiquitina ligasas E3 (SMURF) . Los genes regulados al alza en las AF-MSC en comparación con las BM-, CB- y AM-MSC incluían moléculas implicadas en la maduración y contracción uterinas, como el receptor de oxitocina (OXTR) y la regulación de la síntesis de prostaglandinas, como la fosfolipasa A2 (PLA2G10). Otros genes regulados al alza en este grupo estaban implicados en la transducción de señales relacionadas con (i) la respuesta desencadenada por la trombina ((F2R y F2RL)), (ii) la señalización de hedgehog ((hedgehog aciltransferasa (HHAT)), y (iii) las vías relacionadas con la proteína G (proteína de unión a GTP relacionada con rho (RHOF), regulador de la señalización de la proteína G 5 y 7 (RGS5, RGS7), y fosfolipasa C beta 4 (PLCB4)) .

En estudios recientes sobre las AFSC, Kim et al. describieron por primera vez los cambios de expresión génica en la población total de AFSC durante diferentes pasajes mediante el análisis de microarrays de illumina. Se detectaron 1970 genes expresados diferencialmente y se clasificaron según sus perfiles de expresión en 9 grupos distintos. Los genes con niveles de expresión gradualmente crecientes incluían el ligando de quimiocina (motivo C-X-C) 12 (CXCL12), la cadherina 6 (CDH6) y el receptor de folato 3 (FOLR3). Los genes desregulados fueron, entre otros, la ciclina D2 (CCND2), la queratina 8 (K8), el IGF2, el precursor del péptido natriurético (BNP) B y la proteína de unión al ácido retinoico celular 2 (CRABPII). Para obtener más información, se llevó a cabo un análisis de los datos del chip sobre los genes del envejecimiento y se reveló la regulación al alza de transcripciones de genes, como el factor de crecimiento nervioso beta (NGFβ), el sustrato del receptor de insulina 2 (IRS-2), la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 3 (IGFBP-3) y la apolipoproteína E (APOE). Expresión de genes, como PLAU, factor de transcripción E2F 1 (E2F1), IGF2, gen de susceptibilidad al cáncer de mama tipo 1 (BRCA1), ADN topoisomerasa 2-alfa (TOP2A), antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), la caja de horquillas M1 (FOXM1), el gen de la ciclina-A2 (CCNA2), el homólogo de brotes desinhibidos por benzimidazoles 1 beta (BUB1B), y la quinasa dependiente de ciclinas 1 (CDC2), fue gradualmente regulado a la baja durante el cultivo .

Wolfrum et al. realizaron un análisis global de la expresión génica de las AFSCs en comparación con las iPSCs derivadas de AF (AFiPSC) y las ESCs . Entre ellos, los genes relacionados con la autorrenovación y la pluripotencia (1299 genes, por ejemplo, POU clase 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, proteína de unión a microARN LIN28) y la especificidad de las AFSCs (665 genes, por ejemplo, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatosis tipo 2 (NF2), protectina (CD59), miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidasa (NT5E)). Además, los autores examinaron la expresión de genes asociados a la senescencia y a los telómeros en las AFSC de pasaje temprano y tardío, con el fin de estudiar el efecto de la reprogramación en la superación de la senescencia observada en los cultivos de AFSC. Se identificaron 64 genes expresados diferencialmente en las AFSCs en comparación con las líneas AFiPSC. De ellos, los genes asociados a los telómeros y los genes implicados en la regulación del ciclo celular, como el deficiente en la detención mitótica 2 (MAD2L2), la poli ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), la proteína de replicación A3 (RPA3), la disqueratosis congénita 1 (DKC1), el homólogo de la mutS 6 (MSH6), el homólogo del punto de control CHK1 (CHEK1), la polo-like kinase 1 (PLK1), la homeobox 1 de clase 2 POU (POU2F1), el CDC2, el gen del síndrome de Bloom RecQ helicase-like (BLM), el síndrome de Werner RecQ helicase-like (WRN), la ADN metiltransferasa 1 (DNMT1), la ADN metiltransferasa 3 beta (DNMT3B), la lámina B1 (LMNB1), y el factor de replicación del ADN 1 (CDT1), fueron regulados a la baja en las AFSCs en comparación con las AFiPSCs y las ESCs. Por el contrario, la peptidilproilasa cis/trans isomerasa (PIN1), la lámina A/C (LMNA), la detención del crecimiento y el daño al ADN inducible alfa (GADD45A), la cromobox homóloga 6 (CBX6), la NADPH oxidasa 4 (NOX4), la endoglina (ENG) histona H2B tipo 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A factor de diferenciación del crecimiento 15 (GDF15), y el inhibidor de la serina proteasa 1 (SERPINE1), entre otros, fueron regulados al alza en las AFSCs en comparación con las AFiPSCs y ESCs .

3.2. Células madre de membrana amniótica

Se ha informado del análisis transcriptómico mediante microarrays de ADN para las AM-MSC . Estos datos experimentales proporcionaron información sobre el patrón de expresión génica de las AM-MSC en comparación con los perfiles de expresión génica de las AF, CB y BM-MSC. Se identificaron varios genes regulados al alza en las AM-MSC que participan en la regulación de la adaptación inmunitaria entre la interfaz maternoplacentaria. Entre otros, se encontró que la espondina 2 (SPON2), el interferón, la proteína inducible alfa 27 (IFI27), el receptor de bradiquinina B1 (BDKRB1), la pequeña citoquina inducible miembro de la subfamilia B 5 y 6 (SCYB5, SCYB6), y el homólogo del oncogén relacionado con el virus del sarcoma de Yamaguchi (LYN) estaban regulados al alza. Además, otros genes con una mayor expresión en AM-MSCs en comparación con AF, CB, y BM-MSCs incluyeron (i) factores de transcripción, tales como forkhead box F1 (FOXF1), corazón y derivados de la cresta neural expresados 2 (HAND2), y el factor de transcripción 21 (TCF21) y (ii) enzimas metabólicas, tales como dipeptidil-peptidasa 6 (DPP6), triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO2), y sialiltransferasas (STs) .

4. Proteómica

4.1. Células madre del líquido amniótico

Los estudios proteómicos de la población total de AFSC, incluyendo las células epitelioides (tipo E), las específicas del líquido amniótico (tipo AF) y las fibroblásticas (tipo F), revelaron 2400 manchas que dieron lugar a la identificación de 432 productos génicos diferentes. La mayoría de las proteínas se localizaron en el citoplasma (33%), las mitocondrias (16%) y el núcleo (15%) y representaron principalmente enzimas (174 proteínas) y proteínas estructurales (75 proteínas). También estaba presente un porcentaje relativamente alto de proteínas de membrana y asociadas a la membrana (7%) . Entre las proteínas detectadas, 9 correspondían a células epiteliales, como la cadena D de la ATP sintasa (ATP5H), la subunidad 30 kDa de la NADH-ubiquinona oxidorreductasa (NUIM), la anexina II (Anx2), la anexina IV (Anx4), la proteína ribosomal 40S SA (Rpsa), la glutatión S-transferasa P (GSTP) la proteína mayor de la bóveda y las citoqueratinas 19 y 7 (CK-19, CK-7), mientras que en los fibroblastos se expresaron 12 proteínas, entre ellas las fibronectinas, las tropomiosinas, la transgelina (TAGLN), la subunidad 34 kDa del complejo arp2/3 (P34-arp), la gelsolina (Gsn), el factor de elongación 1-β (EF-1β) y otras. Se encontró que ocho proteínas se expresan en los queratinocitos, incluyendo queratinas, ribonucleoproteínas, Anx2, acetil-CoA acetil-transferasa (ACAT1), y otras, tres se expresan en la epidermis, incluyendo tropomiosinas y queratinas y una en el tipo de célula mesenquimal (vimentina 1 (Vim 1)) .

Estudios recientes proporcionaron pruebas de que una diversidad de expresión de enzimas metabólicas en las células del amnios está implicada en síndromes metabólicos y genéticos, y por lo tanto, su detección podría ser importante para el diagnóstico prenatal. Un análisis más detallado para determinar las enzimas metabólicas específicas presentes en las AFSC fue comunicado por Oh et al. . Se identificaron 99 proteínas, como enzimas de manipulación de carbohidratos, enzimas de manipulación de aminoácidos, proteínas del metabolismo de las purinas y enzimas del metabolismo intermediario.

También se realizó un análisis proteómico en diferentes pasajes de cultivo de las AFSCs CD117+, mostrando variaciones en la expresión de proteínas que se produjeron principalmente en los primeros pasajes . Veintitrés proteínas se expresaron de forma diferencial entre los pasajes tempranos y los tardíos, siendo las proteínas que más se pegaron a la baja, la Col1, la Col2, la vinculina (Vcl), la CRABP II, la estatmina (STMN1) y la cofilina-1 (CFL1). Por el contrario, TAGLN y Col3 aumentan durante los pases . Las proteínas que mostraron niveles desregulados a lo largo de los pasajes fueron la subunidad reguladora de la proteasa 26S 7 (PSMD7), la ubiquitina carboxilo terminal hidrolasa isoenzima L1 (UCH-L1), la proteína nuclear ribonuclear heterogénea H (hnRNP H), y la proteína de unión al ADN TAR 43 (TDP-43) .

En 2007, se construyó el mapa proteómico de las AF-MSCs humanas y se comparó directamente con el de las BM-MSCs . Se identificaron 261 proteínas diferentes en las AF-MSCs con la mayoría de las proteínas localizadas en el citoplasma (41%), mientras que otras se encontraron en el retículo endoplásmico (8%), el núcleo (13%), las mitocondrias (12%), los ribosomas (1%), el citoesqueleto (6%), el citoplasma y el núcleo (5%), y las proteínas secretadas (2%) . Las AF-MSCs expresaron una serie de proteínas relacionadas con la proliferación y el mantenimiento celular, como la ubiquilina-1 (UBQLN1), que se sabe que controla la progresión del ciclo celular y el crecimiento celular, la proteína asociada a la proliferación 2G4 (PA2G4), una proteína reguladora del crecimiento nucleolar la proteína secretada ácida y rica en cisteína (SPARC), que se regula durante la embriogénesis y participa en el control del ciclo celular y la adhesión celular, y el potenciador del homólogo rudimentario (ERH) que también regula el ciclo celular . TAGLN y galectina 1 (Gal 1), ambas presentes en las células madre y relacionadas con la diferenciación, también se expresaron abundantemente en las AF-MSC. Otras proteínas expresadas en altos niveles en las AF-MSCs estaban relacionadas con (i) el desarrollo, como Deltex-3-like (DTX3L), y (ii) la organización y el movimiento del citoesqueleto, como CFL1, la proteína similar a la coactosina (CLP), y la proteína homóloga habilitada (Enah). Como se esperaba, Vim también se expresaba en cantidades elevadas en las AF-MSC. En este estudio, también se describió una comparación detallada de las proteínas comunes identificadas en las células AF y AF-MSCs.

En nuestro estudio posterior, establecimos el mapa proteómico de los dos tipos de células progenitoras mesenquimales AF morfológicamente distintas (SS y RS) por 2-DE. Veinticinco proteínas se expresaron de forma diferencial en las dos subpoblaciones. Las proteínas reguladas en las SS-AF-MSC en comparación con las RS-AF-MSC incluían el precursor de la reticulocalbina 3 (RCN3), el colágeno α1 (I) (COL1α1), el precursor de la proteína 9 de unión a FK506 (FKBP9), el inhibidor 1 de la disociación de Rho GDP (RhoGDI), la proteína 4 del canal intracelular de cloruro (CLIC4), la triptófano-ARNt sintetasa (TrpRS) y la proteína de choque térmico de 70 kD (HSP70). La peroxiredoxina 2 (Prdx2), la proteína de choque térmico de 60 kD (HSP60), la GSTP y la Anx4 estaban reguladas al alza en las RS-AFMPC. Sin embargo, las proteínas identificadas en las RS-AF-MSC sólo incluían la citoqueratina-8, -18 y -19 (CK-8, -18 y CK-19), la catepsina B (CTSB), la CLP y la proteína integrina αV (CD51). Las proteínas relacionadas con el mesénquima, como Vim, Gal, Gsn y prohibitina (PHB), se expresaron en los mismos niveles en ambas poblaciones. Células madre de la membrana amniótica

Un enfoque detallado para el estudio de las proteínas humanas de la AM fue descrito por Hopkinson et al. . En este estudio, los autores realizaron un análisis proteómico de muestras de MA que fueron preparadas para el trasplante humano, mediante el uso de geles 2-DE. También se examinaron los medios de lavado de las muestras de AM y se identificaron las proteínas secretadas. Las proteínas detectadas tanto en los AM como en los medios de lavado sugerían que se había producido una liberación parcial de proteínas. Estas proteínas eran en su mayoría proteínas citoplasmáticas solubles y se clasificaron según su localización subcelular y su función. Un ejemplo de las proteínas más abundantes y consistentes en el AM es la THBS1, de la que se dice que desempeña un papel en la reparación de heridas, la respuesta inflamatoria y la angiogénesis. Mimecan (también llamada osteoglicina/OGN) es otra proteína detectada en la AM que representa un pequeño proteoglicano rico en leucina, que se encuentra en la ECM del tejido conectivo. Se dice que el mimecan mantiene la resistencia a la tracción y la hidratación del tejido . Además, la forma más grande de mimecan se expresaba en las células AM y era susceptible a la escisión proteolítica . La proteína ig-h3 inducida por el TGF-β (βIG-H3), una molécula adhesiva de la MEC que actúa como factor de crecimiento asociado a la membrana durante la diferenciación celular y la cicatrización de heridas, y la intergrina α6 (CD49f), un componente de la integrina α6β4, también estaban presentes en cantidades significativas en las células AM . Es bien sabido que la interacción α6β4-βIG-H3 desempeña un papel importante en la mediación de la adhesión celular y las vías de señalización de la reparación de heridas .

Otro importante estudio de Baharvand et al. se centró en el análisis de la AM humana denudada por el epitelio mostrando diferencias cuantitativas y cualitativas en comparación con la AM no tratada . Investigaron el proteoma del epitelio del AM humano, que se utilizó como nicho de células madre limbares para tratar la reconstrucción de la superficie ocular . Se detectaron 515 manchas en todos los geles de 2DE y se identificaron 43 proteínas mediante MALDI TOF/TOF MS en AM. Las proteínas más abundantes fueron diferentes isoformas de lumican (LUM) y OGN, ambos miembros de la familia de los proteoglicanos (PG). En particular, el OGN podría desempeñar un papel en muchos procesos biológicos, como el crecimiento celular, la angiogénesis y la inflamación. Otras proteínas detectadas fueron el colágeno VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), la cadena beta del fibrinógeno (FGB), la isoforma A de la transglutaminasa 2 (TGM2A), la variante de la b-actina (ACTB), la proteína de choque térmico 5 de 70 kD (HSPA5), el nidógeno 2 (NID2), el CD49f, el βIG-H3 y la nefritis tubulointersticial (TIN). Algunas de las proteínas identificadas en este estudio también estaban relacionadas con la matriz extracelular (MEC). Entre las detectadas, se informó que la fibronectina (FN), las lamininas y el colágeno IV (Col4) y VII promueven la adhesión y la migración epitelial.

5. Secretoma

Recientemente, se ha hecho un progreso significativo con respecto al análisis de las proteínas secretadas de las AFSC. Se ha documentado que el secretoma de las AFSC era responsable de potenciar la vasculogénesis y era capaz de evocar una fuerte respuesta angiogénica en receptores murinos . Según este estudio, un análisis detallado del medio condicionado por las AFSC reveló la presencia de factores proangiogénicos y antiangiogénicos conocidos utilizando la tecnología MAP de Luminex. Se identificaron como proteínas secretadas el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor 1 derivado de células estromales (SDF-1), la interleucina 8 (IL-8), la proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) y dos inhibidores de la angiogénesis, el interferón gamma (IFNγ) y la proteína 10 inducida por el interferón gamma (IP-10). También se demostró que un número relativamente pequeño de AFSC era suficiente para secretar una cantidad detectable de factores de crecimiento y citoquinas proangiogénicas. La secreción de éstas puede regularse de manera dependiente de la dosis según el número inicial de células utilizadas .

Un estudio sistemático sobre las proteínas secretadas por las AFSC llevó a la conclusión de que los factores solubles proangiogénicos de las AFSC pueden mediar el reclutamiento de progenitores endoteliales en un modelo de rata isquémica . En particular, el medio condicionado derivado de las AFSCs podría entregar tópicamente factores de crecimiento angiogénicos y citoquinas en el colgajo de piel del modelo de rata isquémica y fue responsable de desencadenar la reparación endógena mediante el reclutamiento de células progenitoras endoteliales .

En nuestros estudios recientes, examinamos el potencial terapéutico de una AF-MSCs y sus moléculas secretadas en ratones con insuficiencia hepática aguda . Se detectaron diversas citoquinas y factores de crecimiento en el medio condicionado de las AF-MSC. Se detectaron citocinas como la interleucina 10 (IL-10), la interleucina 27 (IL-27), la familia de la interleucina 17 (IL-17E), la interleucina 12p70 (IL-12p70), la interleucina-1 beta (IL-1β) y el antagonista del receptor de la interleucina-1 (IL-1ra), responsables de inducir la regulación a la baja local y sistémica de los mediadores proinflamatorios. También se secretaron SERPINE1, MCP-1 y SDF-1, responsables de promover la reparación de los tejidos. Curiosamente, entre los factores de crecimiento altamente expresados se encontraban el factor de crecimiento de células endoteliales derivado de las plaquetas (PD-ECGF), la endostatina/colágeno XVII (EN/Col17), el activador del plasminógeno urinario (uPA), el TIMP1, el TIMP2, el factor de crecimiento similar al EGF ligado a la heparina (HB-EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF7) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), responsables de la regeneración del hígado y la reparación de los tejidos .

6. Resumen

Los datos actuales hasta ahora sugieren que el líquido amniótico y la membrana amniótica pueden representar fuentes prometedoras de células madre de origen mesenquimal. De hecho, las MSC son más abundantes y se ha descrito una amplia gama de protocolos para su aislamiento. Sin embargo, se ha informado de que las diferentes condiciones de cultivo del mismo tipo de células pueden afectar a su patrón de expresión génica diferencial, lo que representa una limitación para su aislamiento y expansión in vitro. Los estudios que incluyen el análisis fenotípico, utilizando metodologías como la citometría de flujo y la inmunohistoquímica, así como enfoques de transcriptómica, proteómica y análisis del secretoma, tienen como objetivo determinar el perfil proteico de estas células (Figura 1). Se espera que los datos generados por estos estudios aclaren su repertorio diferencial y validen el perfil molecular de estas células madre. Sin embargo, la principal cuestión que urge abordar es el aislamiento de una población homogénea que pueda facilitar los estudios sistemáticos para la elucidación de la función de estas células multipotentes.

Figura 1

Resumen de los marcadores más importantes identificados en las AFC y AMC mediante el uso de análisis transcriptómicos, proteómicos, secretómicos e inmunofenotípicos. Las proteínas identificadas en más de un estudio están marcadas en negrita.

Tales enfoques pueden conducir a la identificación de antígenos clave que reflejan el fenotipo de estas células y explican sus propiedades de características distintas. Este tipo de estudios abrirá el camino para un aislamiento sistemático y eficiente de estas células antes de su uso en el ámbito clínico.

Apéndice

Preguntas para una mayor investigación

¿Cuáles son los métodos de aislamiento y las condiciones de cultivo adecuados de las AFSCs o AMSCs que permitirán la identificación de un fenotipo consistente?

¿Existe un único marcador que pueda utilizarse para el aislamiento de AFSCs o AMSCs?

Las poblaciones de AFSCs y AMSCs son heterogéneas y difieren en sus propiedades fenotípicas y moleculares. Los métodos de aislamiento pueden dar lugar a una población celular homogénea.

Las AFSCs o AMSCs pueden utilizarse como herramientas en medicina regenerativa: establecimiento de condiciones de cultivo con sustancias animales mínimas o inexistentes.

Descubrimiento de marcadores
La caracterización inicial de las AFSCs y de las AMSCs puede realizarse mediante el análisis del inmunofenotipo utilizando marcadores de superficie celular bien caracterizados como los AFSCs: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSCs: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 y PROM1.

La transcriptómica y la proteómica revelaron la identificación de marcadores clave expresados como
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 y Gal; AMSCs: OGN, βIG-H3, y CD49F.
Dado que no hay un marcador común disponible para las AFSC y las AMSC, es necesario emplear un panel más amplio de marcadores. Esto también insta a la realización de más análisis funcionales y de array detallados para definir los marcadores más apropiados para la caracterización de AFSC y AMSC.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.