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Se han identificado muchas de las enzimas implicadas en la biogénesis de péptidos

Los pasos más comunes en el procesamiento de precursores y las enzimas implicadas se muestran en la Figura 18-5. Las endoproteasas implicadas son las prohormona convertasas 1 y 2 (PC1 y PC2), la exopeptidasa es la carboxipeptidasa E (CPE, también llamada CPH y encefalina convertasa) y la enzima α-amidante es la peptidilglicina α-amidante monooxigenasa (PAM). Muchos pasos de su biosíntesis no son exclusivos de los neuropéptidos, como la escisión del péptido señal, la formación de enlaces disulfuro, la adición y posterior modificación de oligosacáridos ligados al N y al O, la fosforilación y la sulfatación. Como se muestra en el diagrama de la Figura 18-3, muchos de los pasos postraduccionales ocurren a medida que los neuropéptidos maduros viajan por el axón hacia la sinapsis en los LDCV. Los últimos pasos de la biosíntesis de los neuropéptidos (Fig. 18-5) son exclusivos de las neuronas y las células endocrinas.

Las enzimas clave en la biosíntesis de los neuropéptidos incluyen endoproteasas, exoproteasas y enzimas que modifican los extremos de los péptidos. El descubrimiento y la caracterización de Kex2p, la endoproteasa que escinde el factor de apareamiento pro-α de la levadura para producir cuatro copias del factor de apareamiento α (Fig. 18-2), fueron clave para el descubrimiento de las prohormonas convertasas de los mamíferos, entre las que se encuentran la furina, la PC1/3, la PC2, la PC4, la PC5/6, la PC7/8/LPC y la PACE4. Las prohormona convertasas comparten homología con las subtilisinas bacterianas y tienen una tríada catalítica Asp-His-Ser, que consiste en tres aminoácidos clave involucrados en la catálisis (denotados D, H y S en la Fig. 18-5). La prorregión de cada una (Fig. 18-5) debe estar presente durante la biosíntesis para que la proteasa se pliegue correctamente, pero debe eliminarse para producir una proteasa activada. Para la PC1 y la furina, la remoción de la proregión ocurre dentro de unos pocos minutos de la biosíntesis mientras la enzima está en el retículo endoplásmico y es probablemente un evento autocatalítico. Para las otras prohormonas convertasas la eliminación de la proregión es mucho más lenta. La expresión de la PC2 activa requiere la coexpresión del péptido 7B2 (Fig. 18-5), que parece realizar una función de chaperona y puede también prevenir la expresión de la actividad endoproteolítica de la PC2 hasta que ésta se haya depositado en los gránulos secretores. No se ha identificado ningún péptido chaperón/inhibidor correspondiente para las otras prohormonas convertasas.

Las endoproteasas de mamíferos más claramente implicadas en el procesamiento de neuropéptidos son la PC1 y la PC2, proteasas dependientes de Ca2+ que se encuentran en los gránulos secretores y cuya expresión está limitada a las neuronas y a las células endocrinas (Fig. 18-5). Otros miembros de esta familia de endoproteasas se expresan más ampliamente, mientras que otros se expresan en lugares restringidos distintos de las neuronas y las células endocrinas. Por ejemplo, la furina se encuentra prácticamente en todas las células y se localiza principalmente en la red trans-Golgi; la furina cataliza cortes importantes en la función peptídica, como el corte inicial de los precursores de la ELH, del factor de crecimiento nervioso y de la hormona paratiroidea, así como el corte dentro del precursor del receptor de la insulina para producir la forma activa del dímero αβ del receptor. La furina también puede ser instrumental en la activación de algunas de las otras enzimas de procesamiento, como la PC2 y la CPE.

La PC1 y la PC2 se escinden en pares seleccionados de aminoácidos básicos en los precursores de péptidos: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys y Arg-Lys. La PC1 también puede catalizar los cortes en los sitios seleccionados de Arg presentes en algunos precursores, como la prosomatostatina y la procolecistoquinina. Los clivajes en los LDCVs por las PCs están estrechamente controlados, y a menudo ocurren de manera muy ordenada (Fig. 18-6). Los clivajes iniciales de la POMC ocurren en menos de 1 hora (Fig. 18-6, pasos 1 y 2), mientras que otros clivajes ocurren sólo después de varias horas (Fig. 18-6, pasos 6 y 7). El corte endoproteolítico de los propéptidos es a menudo la reacción que limita la velocidad del procesamiento biosintético de los péptidos.

El patrón de escisión catalizado por PC1, PC2 y furina cuando se expresan en neuronas y células endocrinas es mucho más selectivo que el patrón de escisión observado en ensayos en tubos de ensayo con enzimas purificadas. Por ejemplo, aunque las prohormonas convertasas suelen escindirse en el COOH-terminal de un par de residuos básicos en sustratos peptídicos modelo, en las células las escindidas pueden estar en medio de los pares de residuos básicos, como en el caso de la escisión de la POMC (Fig. 18-6), donde los residuos básicos están separados y permanecen con los dos péptidos maduros resultantes . Es probable que la concentración de Ca2+ y el pH interno de las LDCV sean dos variables utilizadas por las neuronas y las células endocrinas para regular la actividad endoproteolítica en las LDCV.

Puede demostrarse que otras endoproteasas desempeñan un papel en la biosíntesis de los neuropéptidos. Los principales candidatos son el homólogo de mamíferos de la aspartil proteasa-3 de levadura (YAP-3) y la N-arginina dibásica (NRD) convertasa. Un giro adicional en la biosíntesis de péptidos se observa en el corazón, donde el factor natriurético proatrial (proANF) se almacena en los LDCV y, sin embargo, el ANF maduro se libera de las células auriculares a la circulación. El procesamiento del proANF, que implica la escisión después de un único residuo Arg en el proANF, no puede implicar a la PC1 o a la PC2 ya que hay cantidades insignificantes de esas PC en el corazón.

La PCP es una proteína soluble que se encuentra en prácticamente todos los LDCV en las neuronas y en las células endocrinas (Fig. 18-5) . Elimina residuos básicos, Lys o Arg, de los terminales COOH de los péptidos intermedios producidos por las prohormonas convertasas. Se identificó originalmente por su distribución tisular y su especificidad de sustrato, junto con su inhibición específica por el ácido guanidinoetilmercaptosuccínico (GEMSA). La CPE es una enzima activada por Co2+ y Zn2+ con una corta prorregión que normalmente se elimina durante la maduración de la enzima; a diferencia de las prohormonas convertasas, la CPE es activa con la prorregión unida. La función carboxipeptidasa del procesamiento de péptidos no es normalmente limitante de la tasa, ya que los péptidos intermedios con residuos básicos COOH-terminales sólo se detectan en concentraciones extremadamente bajas en los tejidos o extractos de LDCV. Recientemente, se han identificado otras carboxipeptidasas, en particular la CPE, una forma de membrana integral de la enzima con 3 dominios de carboxipeptidasa. La importancia relativa de la CPE y de estas carboxipeptidasas adicionales en el procesamiento de los neuropéptidos in vivo no está clara. Dado que el corte en un par de residuos básicos puede estar en el centro del par, hay buenas razones para pensar que una aminopeptidasa se encontrará en los LDCVs.

PAM es una enzima bifuncional que se encuentra en casi todos los LDCVs (Fig. 18-5) . La PAM actúa sobre sustratos peptídicos después de la escisión endoproteolítica y la acción de la exopeptidasa, cuando se expone un residuo COOH-terminal de Gly, y convierte el peptidil-Gly en el correspondiente péptido-NH2. Aproximadamente la mitad de los péptidos bioactivos conocidos están α-amidados, y la α-amidación es generalmente crucial para la potencia biológica. Las formas peptidil-Gly y péptido-COOH suelen ser inactivas a concentraciones fisiológicas. El primer paso de la reacción de α-amidación lo realiza la peptidilglicina α-hidroxilante mono-oxigenasa (PHM), que es la porción NH2-terminal de la proteína PAM bifuncional. La PHM une dos átomos de Cu2+ que participan en la catálisis sufriendo ciclos de reducción y oxidación. La PHM utiliza ácido ascórbico como reductor, con un átomo de oxígeno del O2 incorporado al péptido durante el paso de hidroxilación. Así, la PHM es enzimáticamente muy similar a la β-mono-oxigenasa de la dopamina (DBM), que convierte la dopamina en norepinefrina (véase el Cap. 12). El segundo paso de la reacción de α-amidación lo realiza un segundo dominio enzimático de la PAM, la peptidil-α-hidroxiglicina α-amidante liasa (PAL). El dominio PAL constituye una nueva enzima dependiente de iones metálicos divalentes. Las neuronas expresan principalmente una forma de membrana integral de la proteína PAM bifuncional (Fig. 18-5), mientras que un evento adicional de empalme de ARNm permite a algunas células endocrinas expresar versiones solubles de la proteína, que carecen del dominio transmembrana. En las formas de membrana integral de la PAM, el corto dominio COOH-terminal se extiende hacia el citoplasma y participa en el encaminamiento de la PAM entre los LDCV y la superficie celular. El suministro de ascorbato reducido en las LDCV se mantiene gracias al citocromo B561, una proteína que tiene cinco dominios transmembrana y que transporta electrones del ascorbato citosólico al ascorbato en el lumen de las LDCV. El citocromo B561 también se encuentra en las vesículas que contienen catecolamina, donde realiza una función similar para la DBM (véase el Cap. 12). Los tejidos nerviosos y endocrinos mantienen concentraciones de ascorbato reducido unas 100 veces por encima de la concentración sanguínea de ascorbato, mientras que la mayoría de los demás tejidos no concentran ascorbato.

Varios péptidos tienen residuos de ácido piroglutámico NH2-terminal, también denominado ácido glutámico cíclico (<Glu), que son esenciales para la bioactividad, por ejemplo, la hormona liberadora de tirotropina (TRH) y la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La enzima responsable de este paso es la glutaminil ciclasa, que convierte el NH2-terminal original de Gln en <Glu. La regulación y la función de la glutaminil ciclasa aún no se han estudiado ampliamente. Otra modificación importante pero poco frecuente de los péptidos es la α-N-acetilación (Figs. 18-6 y 18-7). Durante el procesamiento de la POMC, la α-N-acetilación aumenta en gran medida la potencia de oscurecimiento de la piel de la ACTH(1-13)NH2 mientras que suprime tanto la potencia esteroidogénica adrenal de la ACTH como la actividad opiácea de la β-endorfina. La(s) enzima(s) responsable(s) de esta modificación no ha(n) sido aún purificada(s) o clonada(s).

Como ejemplo, la Figura 18-6 muestra el patrón de pasos de procesamiento en el sistema POMC . Los pasos endoproteolíticos iniciales (Fig. 18-6, pasos 1-4) están mediados por la PC1 y ocurren en todas las neuronas y células endocrinas productoras de POMC, generalmente en el orden numérico mostrado. Está claro que los pasos 1 y 2 se inician en la red trans-Golgi y continúan en las LDCV, mientras que el paso 4 ocurre sólo en las LDCV. Los pasos 5-7 ocurren sólo en las LDCV y parecen requerir la PC2. En la hipófisis anterior adulta, los corticotropos contienen PC1 pero no PC2 y sólo realizan los pasos 1-4. Sin embargo, durante el desarrollo postnatal temprano, los corticótropos también expresan la PC2 y los clivajes 5-7 se observan transitoriamente en los corticótropos. En la rata, la expresión de la PC2 y el clivaje dentro de la ACTH (clivaje 5) disminuyen simultáneamente unas semanas después del nacimiento, aproximadamente en el momento en que aparece el patrón adulto de control de la ACTH sobre la esteroidogénesis suprarrenal.

Los melanótropos y las neuronas del SNC que fabrican POMC expresan tanto la PC1 como la PC2 y, por tanto, los productos peptídicos más pequeños se ven en estas células. La PAM se expresa en todas las células productoras de POMC, por lo que la α-amidación del péptido de unión (JP), un péptido pequeño sin función biológica clara, ocurre rápidamente en todas las células de POMC (Fig. 18-6). En los melanotropos de la hipófisis intermedia y en las neuronas POMC del núcleo del tracto solitario se produce la α-N-acetilación de la ACTH(1-13)NH2 y de la β-endorfina. En los melanótropos, la α-N-acetilación de la ACTH puede ocurrir antes de la escisión 5. Como se indica en la Figura 18-4, las escisiones particulares realizadas y las modificaciones hechas a los NH2- y COOH-terminales de los productos peptídicos determinan la mezcla de péptidos bioactivos liberados.