El condensador – diferentes tipos. El contraste en el microscopio
En el artículo anterior sobre el ocular, señalé que el ocular se situaba normalmente de forma que su plano focal delantero coincidía con el Plano Primario de Imagen (PIP). El PIP es conjugado con el espécimen en el conjunto de planos conjugados de la imagen, por lo que es útil para medir las características de los especímenes microscópicos.
De la misma manera, el plano focal delantero del condensador es conjugado con el plano focal posterior del objetivo (pero no con el espécimen) en el tren de rayos de iluminación. El condensador, por lo tanto, proporciona un lugar accesible donde podemos alterar o regular el contraste de la imagen mediante la manipulación de los rayos de luz que la iluminan. Estos dos principios surgen del método de iluminación de Köhler, que se trató en la parte 3 de esta serie.
La función del condensador
El condensador cumple dos funciones en el microscopio. En primer lugar, proporciona un área de luz uniforme en el campo de visión en el plano de la muestra e ilumina la apertura del objetivo de manera uniforme con luz de ángulo suficiente pero controlable. En segundo lugar, como se ha mencionado anteriormente, proporciona un medio para regular el contraste (Bradbury & Evennett, 1996). La forma más sencilla de condensador es el espejo cóncavo, pero éste no es útil para objetivos por encima de NA 0,2 aproximadamente. Si su microscopio tiene un espejo y una fuente de luz remota, la parte plana del espejo debe utilizarse junto con cualquier condensador de subestadio instalado. Esto se debe a que, estrictamente hablando, el condensador debe recibir una iluminación paralela y así llevar esta luz a un foco en el plano focal posterior del condensador (donde se encuentra la muestra).
Tipos de condensador
El tipo de condensador más utilizado es el condensador Abbe para la microscopía de campo claro (Figura 1a, 1b). Está construido con dos o tres lentes, y la lente superior de enfoque corto normalmente puede voltearse fuera de la trayectoria óptica (1a), o desenroscarse (1b), para llenar el campo de visión con objetivos de baja potencia. Este sencillo iluminador será suficiente para la mayoría de los tipos de microscopía. Se diseñó originalmente para proporcionar haces estrechos (o «lápices») de luz oblicua desde una abertura colocada excéntricamente en el plano focal delantero del condensador. La figura 1c muestra un iluminador Abbe simple de dos lentes montado en un aparato de subestadio que podía girarse y moverse excéntricamente para proporcionar iluminación oblicua. La figura 1d muestra un condensador de baja potencia diseñado para llenar completamente el gran campo de visión de los objetivos de muy bajo aumento.
Aunque se puede citar una apertura numérica para el condensador (a menudo 0,9 NA para los condensadores secos y 1,4 NA como máximo para los tipos de inmersión en aceite), estas cifras no dan ninguna indicación de la NA para la que los rayos de iluminación se corrigen para la aberración esférica. En muchos condensadores simples, un cono de luz sólido para la iluminación axial rara vez se corrige para la aberración esférica por encima de 0,45 NA. Para un trabajo de alta calidad, y para resolver la estructura en el límite de la resolución, los condensadores deben ser corregidos para las aberraciones. Los condensadores totalmente corregidos, al igual que los objetivos, contienen muchos elementos de lente y pueden corregirse casi en el mismo grado. El condensador acromático-aplanático (1e) está corregido tanto para la aberración esférica como para la cromática, y debe utilizarse para los trabajos de mayor calidad, así como para la fotomicrografía en color. Los condensadores planos se corrigen sólo para la aberración esférica.
Los llamados condensadores «universales» (figura 2) son multifuncionales. Constan de un disco giratorio que sostiene una selección de diafragmas de apertura, filtros, topes de parche, placas de fase o prismas de Wollaston para el contraste de interferencia diferencial (DIC). Esta disposición permite cambiar de un método de contraste a otro de forma cómoda y sencilla. El tope de parche de fondo oscuro sólo funciona, por lo general, hasta NA 0,5 o más. Para utilizarlo con objetivos de mayor NA, debe usarse un condensador de fondo oscuro especialmente construido (Figura 3). Para más detalles sobre su uso, y otros métodos de mejora del contraste, véase Bradbury & Evennett (1996).
Figura 2. Condensadores universales. La imagen central muestra la tapa superior retirada, mostrando el disco giratorio donde se encuentran los ánulos de fase de apertura, los prismas DIC, los topes de parche de fondo oscuro, los discos Rheinberg y los filtros de modulación Hoffman. La mayoría de los condensadores universales poseen un iris de apertura para el trabajo de campo claro, varios ánulos para el contraste de fase y un tope de fondo oscuro para el fondo oscuro de baja potencia.
Figura 3. Condensadores de tierra oscura. 3(a) Condensador de tierra oscura seco. 3(b) & 3(c) Condensadores de tierra oscura de inmersión en aceite. 3(d) Condensador de fondo oscuro de inmersión en aceite ajustable; este condensador puede ajustarse para adaptarse a diferentes grosores de diapositivas, para dar una imagen de fondo oscuro de alta calidad.
Microscopía de luz transmitida y reflejada
La disposición del microscopio de luz transmitida exige un condensador separado, ya que la luz se condensa primero en la muestra (donde la luz interactúa con la materia), y luego es recogida por el objetivo más allá del eje óptico.
La situación en el microscopio de luz reflejada es diferente. En este caso, la trayectoria del rayo se dobla en torno al eje de la muestra donde la luz se refleja en su superficie. El objetivo actúa como su propio condensador, y la alineación del microscopio de luz reflejada se simplifica mucho (véanse los diagramas de rayos en la parte 2 de esta serie). Sin embargo, es difícil acceder al plano focal posterior del objetivo (plano focal anterior cuando se utiliza como condensador), por lo que se utilizan lentes suplementarias para crear una posición en la que la imagen de los diafragmas y los filtros se conjugue con el plano focal posterior.
El sistema de luz incidente es muy útil para la microscopía de fluorescencia, principalmente porque la iluminación del espécimen es sencilla, es más eficiente (dando imágenes más brillantes a altos aumentos) y se permite la combinación con otros métodos de contraste por luz transmitida.
Figura 4. Ilustración de un epi-iluminador para microscopía de luz reflejada
Este epi-condensador tiene dos tipos de objetivos de luz reflejada instalados en su puente. El objetivo que se utiliza está diseñado para la iluminación de fondo oscuro, mientras que los otros dos objetivos que se pueden ver para el trabajo de luz reflejada de campo brillante. Los collares anchos que rodean estos dos últimos objetivos permiten centrar el objetivo en el eje óptico. La «D» de la carcasa del epiluminador indica el inserto intercambiable que permite utilizar la unidad para la iluminación de campo oscuro. Puede cambiarse por un espejo plano para la microscopía de campo claro con luz reflejada. El condensador de luz transmitida se ha retirado de debajo de la platina.
Si el objetivo actúa como su propio condensador en la microscopía de luz reflejada, ¿por qué no se utilizan también objetivos para la iluminación en la microscopía de luz transmitida? Aparte de la dificultad práctica de acceder al plano focal posterior del objetivo, es difícil dar a los objetivos un uso multifuncional, y el ángulo de iluminación no suele ser controlable (mediante un diafragma iris en el plano focal posterior del objetivo).
Principios básicos de la mejora del contraste
Se necesita una visibilidad o contraste suficiente para que podamos percibir el detalle de la imagen que resuelven nuestros microscopios. La selectividad es importante: necesitamos al menos algunas diferencias regionales dentro del objeto, y entre el objeto y el fondo, para discernir los detalles.
El contraste en la imagen se obtiene por tres medios, ya sea por separado o en combinación. Son:
- interacción entre el espécimen y la luz,
- manipulación de la iluminación, y
- manipulación del medio de grabación de la imagen.
La alteración del contraste en la parte (c) puede lograrse mediante el revelado y/o la impresión fotográfica, y también utilizando el contraste electrónico de las imágenes analógicas de vídeo o digitales. Sin embargo, el condensador es fundamental en las partes (a) y (b) para manipular el contraste y la visibilidad en la imagen. Pueden encontrarse más detalles sobre los aspectos teóricos y prácticos de las técnicas de contraste en microscopía óptica en Bradbury & Evennett, 1996 y Sanderson, 2002, 2000, 1998 y 1994. Brevemente, las formas más conocidas de generación de contraste son el campo brillante, la iluminación oblicua, el fondo oscuro & Rheinberg, el contraste de fase y el DIC. También es posible combinar estos métodos con diferentes formas de iluminación (por ejemplo, luz polarizada con Rheinberg, o contraste de fase por campo brillante transmitido con fluorescencia incidente). Dado que el aumento del contraste depende en gran medida del microscopista, nunca se insistirá lo suficiente en la importancia del uso adecuado del condensador.
El condensador tiene que estar bien enfocado (véase la parte 3, preparación del microscopio para la iluminación Köhler) para conseguir la mejor calidad de imagen. Esto es así sea cual sea el método de mejora del contraste (campo claro, fase, fondo oscuro) que se utilice. El efecto más evidente de un condensador desenfocado en la microscopía de campo claro es una pérdida significativa de poder de resolución que da, a su vez, una imagen «podrida» con halos de difracción alrededor de cada punto de la imagen. El mismo resultado se produce si se omite la lente superior (de enfoque corto) o se deja desplegada cuando se utiliza un objetivo de alta potencia, y el plano focal posterior del objetivo no se llena completamente de luz.
Cuando se intenta realizar una microscopía de contraste de fase con un condensador mal enfocado, el anillo del condensador no suele coincidir con el diámetro del anillo de fase en el plano focal posterior del objetivo, y se pierde cualquier mejora del contraste. Los problemas de enfoque del condensador también pueden dar lugar a una mala microscopía de fondo oscuro, si la imagen del tope de parche no ocluye completamente la iluminación directa del objetivo. La siguiente parte de esta serie vuelve al objetivo, y considera la longitud del tubo, y cómo determinar la distancia focal, el aumento, la apertura y otros parámetros de sus objetivos.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-vol set) 0-12-164725-0; vol 3 only = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.